黃連生物堿4種提取方法的比較

摘要：采用超聲波法、回流法、冷浸法和酶輔助冷浸法提取黃連生物堿，采用高效液相色譜法對提取液中的生物堿含量進行檢測。結果表明，超聲波法、回流法、冷浸法和酶輔助冷浸法的黃連小檗堿提取率分別為26.10%、52.24%、54.15%和81.27%；總生物堿提取得率分別為28.66%、59.70%、61.58%和89.36%。酶輔助冷浸法提取黃連生物堿所得提取率較高，優于其他3種提取工藝。

關鍵詞：黃連；生物堿；超聲波法；回流法；冷浸法；酶輔助冷浸法

中圖分類號：S567.5+2；R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）23-5452-02

Comparative Study of 4 Different Extraction Methods for Alcaloids from Rhizoma Coptidis

NING Na，YANG Zheng-shui，HAN Jian-jun

（Department of Pharmacy， Tongren Vocational Technical College， Tongren 554300，Guizhou，China）

Abstract： Ultrasonic method， reflux method， cold-soaking method and enzyme-assisted cold-soaking method were used to extract alkaloids from Rhizoma Coptidis； and HPLC was used for quantitative analysis of alkaloids. The results indicated that the yield of berberine of ultrasonic extraction， reflux method， cold-soaking method and enzyme-assisted cold-soaking method was 26.10%， 52.24%， 54.15% and 81.27%， respectively. And the yield of total alkaloids of the 4 methods was 28.66%， 59.70%， 61.58% and 89.36%， respectively. The extraction yield of alkaloids of enzyme-assisted cold-soaking method was higher than other three extraction methods.

Key words： Rhizoma Coptidis； alkaloids； ultrasonic method； reflux extraction； cold-soaking method； enzyme-assisted cold-soaking method

黃連（Rhizoma Coptidis）為黃連屬植物黃連（Coptis chinensis Franch.）、三角葉黃連（C. deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao）或云南黃連（C. teeta Wall.）的干燥根莖，具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效[1]。黃連主要含有藥根堿、巴馬汀、小檗堿等生物堿類物質。黃連生物堿的提取方法主要有微波法[2]、超聲波法[3]、回流法[4]等。為提高其提取率，本研究在對冷浸法的基礎上加入酶輔助提取，并與超聲波法、回流法和傳統的冷浸法進行比較研究，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃連藥材購自天津藥材公司，經天津醫科大學生藥教研室周曄教授鑒定為黃連（C. chinensis Franch.）的干燥根。主要儀器有Waters高效液相色譜儀、UV-3010/3310分光光度計、PHS-25型精確酸度計等。主要試劑鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿購自中國藥品生物制品檢定所，批號分別為110713-200208、110732-200506、0733-200005；纖維素酶購自天津利華酶制劑技術有限公司，批號08-03-19，酶活力5 109.52 U/g；果膠酶購自天津利華酶制劑技術有限公司，批號08-05-19，酶活力10 000 U/g。乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃連生物堿的制備 ①超聲波法。取黃連藥材（長5～7 mm，下同）1 kg，按1∶10的料液比（m∶V， g/L，下同）加入0.25%的硫酸水溶液，超聲波提取3次，每次提取的時間為30 min。收集、合并3次提取得到的提取液，濃縮并定容至250 mL。精確吸取1.5 mL定容至100 mL，進樣10 μL。②回流法。取黃連藥材1 kg，用0.25%的硫酸水溶液加熱回流提取3次，料液比為1∶10，提取時間分別1、2、3 h。收集、合并3次提取得到的提取液，濃縮并定容至250 mL。精確吸取1.5 mL定容至100 mL，進樣10 μL。③冷浸法。取黃連藥材1 kg，用0.25%的硫酸水溶液冷浸提取2次，料液比1∶10，每次提取時間為24 h。收集、合并2次提取得到的提取溶液，濃縮并定容至250 mL。精確吸取1.5 mL定容至100 mL，進樣10 μL。④酶輔助冷浸法。取黃連藥材1 kg，按1∶8的料液比浸泡于pH 4.0的0.25%硫酸水溶液，加入0.9%（占藥材質量的百分比，下同）纖維素酶并于35 ℃的水浴中酶解2.5 h，再按照③的條件進行常規冷浸提取。

1.2.2 有效成分的測定 ①對照品溶液的制備。精確稱取鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿對照品適量置于同一容量瓶中，加甲醇制成每毫升含鹽酸小檗堿28 μg、鹽酸巴馬汀10.13 μg、鹽酸藥根堿9.89 μg的混合溶液，搖勻。②色譜條件。色譜柱：DIKMADiamondsil C18 柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm），流動相：乙腈-0.1 mol/L 磷酸二氫鉀（體積比30∶70），流速：1 mL/min，柱溫：40 ℃，AUFS：2.000，進樣量為10 μL。通過紫外全波長掃描（200～700 nm），確定檢測波長為345 nm。③標準曲線的繪制。取對照品混合液分別進樣4、6、8、10、12、14、16 μL進行色譜分析。以標準品的含量為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線。④黃連生物堿供試品溶液的制備。將黃連藥材粉碎，過40目篩，混合均勻，稱取樣品0.1 g，置于100 mL容量瓶中，加入體積分數1%的鹽酸甲醇溶液至刻度，稱重，超聲波處理30 min，冷卻后稱重，加體積分數1%的鹽酸甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，經微孔濾膜（0.45 μm）過濾，取濾液作為黃連的供試品溶液。

黃連生物堿提取率=提取得到的生物堿質量/（實際藥材中的生物堿含量×黃連質量）×100%

2 結果與分析

2.1 黃連生物堿高效液相色譜結果

對黃連生物堿對照品及供試品溶液進行高效液相色譜分析（圖1、圖2），巴馬汀、藥根堿、小檗堿的保留時間分別為7.18、10.25和11.85 min。在試驗濃度范圍內3種生物堿的濃度與峰面積呈良好的線性關系，回歸方程分別為Y藥根堿=4.16×106X+ 1.00×104，r=0.999 4；Y巴馬汀=4.23×106X-1.42×103，r=0.999 8；Y小檗堿=3.86×106X-9.60×103，r=0.999 8。取標準品混合液10 μL，分別連續進樣6次，進行精確度測驗，得到鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿峰面積的相對標準差（RSD）分別為0.75%、0.75%和0.85%，表明檢測結果可靠。

2.2 4種方法的黃連生物堿提取率結果

4種方法中黃連生物堿的提取率結果如表1所示。由表1可知，超聲波法、回流法、冷浸法和酶輔助冷浸法4種提取方法中，酶輔助冷浸法的小檗堿、巴馬汀和藥根堿的提取率均為最高，超聲波法的3種生物堿提取率均為最低。超聲波法提取率低可能與超聲波提取時間較短有關。酶輔助冷浸法中由于使用纖維素酶酶解破壞了植物細胞壁，使有效成分更易溶出，因此生物堿提取得率較傳統的冷浸法有較大的提高。

2.3 加樣回收率試驗結果

精確稱取已測含量的黃連原藥材過篩粉末9份，每份0.05 g，準確加入對照品適量，按“1.2.2”的方法制備黃連生物堿供試品溶液并測定3種生物堿的含量。鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的平均加樣回收率分別為99.46%、98.85%、99.51%。

3 小結與討論

參照文獻[5]、[6]在預實驗中分別以純水、0.25%的硫酸水溶液、乙醇及酸醇為溶劑提取黃連中的生物堿，以總生物堿提取率及小檗堿提取率為指標，結果表明超聲波法、冷浸法及回流法中以0.25%硫酸水溶液和酸醇的提取得率較高。從工業生產成本、安全及對環境的影響考慮，本研究選擇0.25%硫酸水溶液作為提取溶劑。

試驗結果表明3種提取黃連生物堿的傳統工藝中以冷浸法的生物堿提取得率最高，略高于回流法的提取率。加入生物酶輔助提取后黃連小檗堿的提取率達到81.27%，總生物堿提取率達到89.36%，比傳統冷浸法分別提高了50.08%和45.11%。酶輔助冷浸提取法的建立對進一步加強黃連藥用資源的開發和利用有積極意義。

參考文獻：

[1] 中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[Z].北京：化學工業出版社，2000.

[2] 王道武，龐 雪，趙全成，等.微波輔助提取黃連生物堿及其毛細管電泳分析[J].廣東化工，2010，37（10）：35-37.

[3] 肖谷清，龍立平，王嬌亮，等.微波、超聲及其聯用萃取黃連中總生物堿的比較研究[J].光譜實驗室，2010，27（3）：844-849.

[4] 汪蘭芳，方優妮，王 平，等.正交試驗優選失眠貼中黃連乙醇回流提取工藝[J].湖北中醫學院學報，2010，12（5）：31-33.

[5] 徐 媛，張 琰，劉 新，等.正交試驗法優選黃連中小檗堿提取工藝[J].中國中醫藥信息雜志，2011，18（5）：60-62.

[6] 胡寶平，稅丕先.小檗堿提取工藝研究進展[J].瀘州醫學院學報，2011，34（2）：214-216.

（責任編輯 向 闈）