高產油楊樹內生真菌發酵條件的優化

摘要：以油楊樹產脂內生真菌為試驗菌株，考察了不同發酵條件如碳源、氮源、無機鹽質量分數和pH對菌體生長和油脂積累的影響。結果表明，優化的培養基中各營養元素的質量分數分別為葡萄糖8%、酵母膏0.6%、硫酸鎂0.7%、硝酸鉀0.5%、磷酸二氫銨0.4%、硫酸銨0.4%，pH為5.3。此條件下真菌發酵產油脂的得率為49.88%。

關鍵詞：油楊樹內生真菌；油脂；發酵

中圖分類號：Q939.97；TQ929 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）23-5439-03

Optimization of Fermentation Conditions for Oil Production by Poplar Entophyte Fungus

ZHANG Xue-song1，ZHU Yuan2，GAO Da-xiang1，ZHAO Gui-hua1

（1.Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry， Jurong 212400， Jiangsu， China；

2.Nanjing Xiaozhuang University， Nanjing 210017， China）

Abstract： The effects of different fermentation conditions such as content of carbon source， nitrogen source and inorganic salts and pH on fungus growth and oil accumulation of oil poplar entophyte fungus were studied. The results showed that optimal mass ratio of nutrition elements in medium was glucose 8%， yeast extract 0.6%， MgSO4 0.7%，KNO3 0.5%，NH4H2PO4 0.4%，（NH4）2SO4 0.4%， and the optimum pH was 5.3. The yield of oil in fungus under such conditions was 49.88%.

Key words： oil poplar endophytic fungus； microbial grease； fermentation

油脂不僅是食品中不可缺少的重要成分之一，而且在工業上有重要用途。傳統的油脂生產主要來源于動植物的油脂。在當今工業生產高速發展以及世界人口不斷增加的情況下，油脂呈現出供不應求的趨勢。針對這一情況，科學家們正在借助生物技術手段，利用微生物發酵把使用價值較低的農副產品和食品工業的廢棄物轉化為油脂[1]。目前，國內外已有各種酵母菌發酵產油脂的成熟技術，但對內生真菌的產脂研究甚少，特別是對油楊樹內生真菌產脂的研究尚未見報道。

本研究以油楊樹產脂內生真菌為供試菌株，以優化后的PDA培養基為產油脂基礎培養基進行發酵培養，在培養60 h后通過酸熱法提取油脂，以油脂得率為指標，考察培養基中不同的碳源、氮源、無機鹽質量分數以及pH等因素對發酵的影響，優化油楊樹產脂內生真菌的實驗室發酵條件。

1 材料與方法

1.1 菌種

油楊樹產脂內生真菌YM112201，由江蘇農林職業技術學院生物技術研發中心分離純化，保存于PDA培養基中[2]。

1.2 試驗方法

1.2.1 發酵產脂工藝流程[3] 菌種→斜面活化→種子液→發酵培養→油脂提取與檢測。

1.2.2 培養基及培養方法 ①固體培養基。馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂2%（均為質量分數，下同），pH自然，滅菌條件為121 ℃、30 min。②優化搖床種子培養基[4]。葡萄糖4%、蛋白胨0.5%、磷酸二氫鉀0.3%、硫酸鎂0.2%，pH 5.5，培養條件為裝液量50%，接種量10%，30 ℃、105 r/min、18 h。③基礎發酵培養基[5]。葡萄糖4%、酵母膏0.4%、硫酸鎂0.5%、硝酸鉀0.9%、磷酸二氫銨0.3%、硫酸銨0.6%，pH 5.5，培養條件為30 ℃、120 r/min、60 h，接種量10%，裝液量40%。

1.2.3 指標測定 ①生物量。將搖瓶發酵的培養物經離心取沉積物（濕菌體），50 ℃下干燥1 h得到干菌體，生物量=干菌體質量（g）/發酵液體積（L）[6]。②油脂的提取和測定。稱取5 g干菌體，加入30 mL 4 mol/L的鹽酸，振蕩混合，室溫放置30 min后沸水浴3 min，低溫速冷，重復2次，再加入2倍體積的氯仿—甲醇（體積比1∶1）混勻，5 000 r/min離心10 min，取氯仿層，揮發去除氯仿后得油脂[7，8]。

油脂得率=油脂質量/菌體干重×100%

1.2.4 單因素試驗 設置單因素試驗分別考察發酵培養基中碳源、氮源、無機鹽質量分數及pH對菌體發酵后生物量及油脂得率的影響。①葡萄糖。培養基中碳源葡萄糖的質量分數分別為1%、2%、4%、6%、7%、8%、9%、10%。②酵母膏。培養基中酵母膏的質量分數分別為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.9%。③硫酸鎂。培養基中硫酸鎂的質量分數分別為0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.0%。④硝酸鉀。培養基中硝酸鉀的質量分數分別為0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.0%、1.5%。⑤磷酸二氫銨。培養基中磷酸二氫銨的質量分數分別為0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.8%。⑥硫酸銨。培養基中硫酸銨的質量分數分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.5%。⑦pH。培養基pH分別為4.5、4.9、5.3、5.7、6.1。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖質量分數對油脂得率和菌體生物量的影響

葡萄糖是最適合細胞生長與油脂合成的碳源，本試驗以葡萄糖作為碳源，考察其在培養基中的質量分數對菌體生物量和油脂得率的影響，結果見圖1。從圖1可以看出，隨著葡萄糖質量分數的升高，菌體生物量和油脂產量先升高，在葡萄糖質量分數為8%時達到最高，之后下降。葡萄糖濃度過低會導致細胞生長缺乏足夠的碳源，但葡萄糖濃度過高則會導致發酵液黏稠，傳質狀況差，大量能量被消耗于非生產用途，造成浪費，對產物的合成不利。另外，過高的葡萄糖濃度會產生過高的滲透壓，也會抑制菌體的生長。

2.2 酵母膏質量分數對油脂得率和菌體生物量的影響

培養基中氮源濃度和碳氮比是影響菌體油脂含量的主要因素。一般來說，培養基中含氮化合物越多則細胞蛋白質含量越多，因此在實際生產中，培養初期供給量較大的氮源使微生物迅速增殖以獲得大量菌體細胞，后期改為含糖量多的培養條件以使油脂積累，提高油脂含量。酵母膏為天然有機氮源，培養基中酵母膏質量分數對油脂得率和菌體生物量的影響結果見圖2。從圖2可以看出，菌體生物量和油脂得率都隨酵母膏質量分數的升高呈先升后降的趨勢，酵母膏的質量分數為0.6%時油脂得率最高，為20.94%。培養基中含氮量增加會使油脂積累量升高，但氮源濃度過高時菌體不能順利地實現從生長型到產物積累型的轉變，會出現抑制油脂積累的現象。

2.3 硫酸鎂對油脂得率和菌體生物量的影響

鎂離子是某些酶的輔基或激活劑，其對核糖體、核酸、細胞膜有穩定作用。培養基中鎂離子質量分數不同時菌體生物量和油脂得率均有較大變化（圖3）。從圖3可以看出，當硫酸鎂質量分數為0.7%時油脂得率最大，為25.81%，而當硫酸鎂濃度高于0.7%時，油脂得率降低，可能是過多的鎂離子與培養基中的氨氮以及磷酸根結合，抑制微生物的生長與代謝。

2.4 硝酸鉀對油脂得率和菌體生物量的影響

硝酸鉀可以作為速效氮源供細胞使用，且鉀離子與細胞透性有關，其含量變化也會對菌體的生長和代謝造成影響。硝酸鉀質量分數對菌體生物量和油脂得率的影響結果見圖4。由圖4可以看出，當硝酸鉀質量分數為0.5%時油脂得率最高，為32.92%。由于菌體生長時需要的鉀離子濃度低于產脂時的需要量，故在試驗范圍內硝酸鉀質量分數升高，菌體生物量會降低。

2.5 磷酸二氫銨對油脂得率和菌體生物量的影響

磷主要以H2PO4-形式加入，是核酸、蛋白質等重要細胞物質的組成部分，又是許多輔酶、高能磷酸鍵的組成部分，因此磷在菌體生長、繁殖和代謝活動中起著極其重要的作用。磷酸二氫銨質量分數對菌體生長和油脂積累的影響結果見圖5。由圖5可以看出，磷酸二氫銨質量分數為0.4%時油脂得率最高，為38.40%。磷元素有利于糖代謝的進行，能促進微生物的生長，但其添加量過多會抑制某些酶的活性，對產物的合成有抑制作用。

2.6 硫酸銨對油脂得率和菌體生物量的影響

銨離子在油脂合成中是必需的，常以硫酸銨的形式加入，同時銨鹽也可以作為無機氮源。硫酸銨質量分數對菌體生長和油脂積累的影響結果見圖6。由圖6可以看出，硫酸銨質量分數為0.4%時油脂得率最高，為46.01%。硫酸銨作為一種生理酸性物質被微生物迅速利用后產生硫酸，使pH下降，從而抑制了生物量與油脂得率的升高。

2.7 pH對油脂得率和菌體生物量的影響

真菌的生長和代謝合成油脂的過程均對pH有著嚴格的要求。從圖7可以看出，pH為5.3時菌體生物量和油脂得率都較高，油脂得率為49.88%，pH高于5.3時菌體生物量升高但油脂得率下降。

3 結論

通過單因素試驗考察了培養基中碳源、氮源、無機鹽的質量分數和pH對高產油楊樹內生真菌發酵產油脂過程中菌體生物量和油脂得率的影響。結果表明，優化的發酵培養基中各營養元素的質量分數分別為葡萄糖8%、酵母膏0.6%、硫酸鎂0.7%、硝酸鉀0.5%、磷酸二氫銨0.4%、硫酸銨0.4%，適宜的pH為5.3，此時油脂得率為49.88%。

參考文獻：

[1] 劉俊利.食用微生物油脂[J].糧油倉儲科技通訊，2004（1）：50-51.

[2] 趙桂華，石立巖，楊懷光，等.楊樹內生真菌的分離和鑒定[J].南京林業大學學報（自然科學版），2008，32（2）：76-78.

[3] 馬麗娟，王海明，溫玉鳳，等. 絲狀真菌發酵產油脂培養基及發酵條件的優化研究[J].長春工業大學學報（自然科學版），2008， 29（4）：459-463.

[4] 張雪松，趙桂華.高產油脂楊樹內生真菌種子培養基優化[J].糧油加工，2011（12）：50-53.

[5] 趙豐麗，余 蕓，張 弘，等.產脂酵母產脂培養條件研究及脂肪檢測方法初探[J].生物技術，2006，16（5）：47-50.

[6] 孔凡敏，趙祥穎，田延軍，等.酸熱法提取酵母油脂條件的研究[J].中國釀造，2010（5）：143-146.

[7] 張 玲，李植峰，譚亞芳，等.一種簡便、快速的真菌油脂提取方法[J].生物技術，1999，9（6）：43-44.

[8] 王禎旭. 微生物油脂生產與利用[J].糧食與油脂，2005（10）：13.

（責任編輯 向 闈）