Cd²⁺對中肋骨條藻的毒性效應

摘要：研究了重金屬Cd2+對中肋骨條藻（Skeletonema costatum）的生長以及藻細胞超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性，以及谷胱甘肽（GSH）、類胡蘿卜素（Car）及丙二醛（MDA）含量的影響。結果表明，Cd2+對中肋骨條藻生長的72 h 半效應濃度（EC50）為378 μg/L。藻細胞GSH含量隨Cd2+濃度的升高而迅速升高，峰值出現在800 μg/L，當Cd2+濃度大于800 μg/L時GSH含量略呈下降趨勢，但其含量仍高于對照；Car含量則隨Cd2+濃度的升高持續下降。Cd2+濃度為100 μg/L時SOD活性達峰值，較對照上升了26.8%（P<0.05）；APX活性則隨Cd2+濃度升高的變化相對平緩；暴露時間試驗中，觸毒6 h時SOD活性達峰值。在Cd2+脅迫下藻細胞膜脂被氧化自由基所氧化，產生大量的MDA。結果顯示，中肋骨條藻細胞的SOD、APX活性和MDA含量與水體中的Cd2+濃度具明顯的相關性。

關鍵詞：Cd2+；中肋骨條藻（Skeletonema costatum）；毒性效應

中圖分類號：Q949.27 文獻標志碼：A 文章編號：0439-8114（2012）23-5428-04

Toxicity Effects of Cd2+ to Skeletonema costatum

ZHENG Wei1，2，LI Xin-shu1，2，HE Pei-min2

（1.School of Marine Science and Technology， Huaihai Institute of Technology， Lianyungang 222005， Jiangsu， China；

2.College of Fisheries and Life Science， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China）

Abstract：The effects of heavy metal Cd2+ on the growth of Skeletonema costatum and the content of superoxide dismutase （SOD）， ascorbate peroxidase （APX）， glutathione （GSH）， carotenoids （Car） and malondialdehyde （MDA） in the algal cells were studied. The results showed that the 72 h EC50 of Cd2+ on the growth of S. costatum was 378 μg/L. The GSH content increased as the Cd2+ concentration increasing， and arrived the highest GSH content with 800 μg/L Cd2+. The GHS decreased when the Cd2+ concentration was larger than 800 μg/L， but still higher than the control. The Car content decreased as the Cd2+ concentration increasing. The SOD activity arrived the highest with 100 μg/L Cd2+， and increased 26.8%（P<0.05） comparing to the control. The APX activity changed relatively less with Cd2+ concentration increasing. In the exposing experiment， the SOD activity arrived the highest after 6 hours. Under the stress of Cd2+， the algal cell membrane lipids were oxidated by oxygen free radicals， resulting in a large number of MDA. Generally， the SOD， APX activity and MDA content of S. costatum were significantly correlated with the Cd2+ concentration in the water.

Key words：Cd2+； Skeletonema costatum； toxicity effects

近年來，中國近海海洋環境遭受了前所未有的污染，嚴重損害了海洋的環境和資源，造成了近岸漁業和養殖業的衰退、生物種類銳減、水產品健康質量下降[1]。海洋微藻是水產經濟動物的優質餌料，同時對重金屬的轉移、分配和歸趨等具有重要作用。與水生動物相比，海洋微藻對重金屬脅迫更加敏感，并且具有生長周期短、易于分離培養和可直接觀察細胞水平上的中毒癥狀等優點，是較為理想的試驗材料[2，3]。有研究認為，海洋生物體內的抗氧化防御系統可以作為監測海洋污染狀況的生物標志物[4]。目前，有關環境壓力與海洋微藻的抗氧化防御系統之間關系的研究相對較少。Cd是一種具有潛在危害的重金屬，在水環境中非常穩定，除了直接影響藻類及其他水生植物外，對整個水生食物網也具有潛在的威脅。中肋骨條藻（Skeletonema costatum）是重要的生物餌料，在海水養殖生產中應用非常廣泛。本試驗研究了重金屬Cd2+脅迫下中肋骨條藻的生物學效應，并從活性氧化自由基的角度探討了重金屬對海洋微藻毒性的可能機制，以期對海洋環境監測和海洋環境保護提供科學支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

中肋骨條藻由淮海工學院海洋學院實驗室提供。CdCl2·2.5H2O為分析純，購自上海振欣試劑廠。用無菌水配制CdCl2母液（156 mmol/L），備用。試驗海水取自江蘇省連云港連島海區（海水中的Cd2+濃度為0.152 μg/L），黑暗沉淀7 d后用0.45 μm的濾膜過濾，煮沸消毒，冷卻后用來配制培養液。

1.2 試驗設計

微藻培養液選用f/2營養鹽配方[5]，略有改進。為減少配方中各元素對重金屬的影響，不添加原配方中的EDTA和微量元素；為維持pH值相對穩定，另加緩沖劑1 g/L NaHCO3、10 mg/L尿素。培養條件：光照度3 000～3 500 lx，光源為日光燈，光暗比為12 h∶12 h，pH為（8.3±0.2），鹽度為（3.02±0.05）%，溫度為（21.0±0.5） ℃，于指數生長期接種，均為一次性培養，中間不加營養鹽。用于培養微藻的三角燒瓶先在稀鹽酸中浸泡數日，再分別用相應濃度的Cd2+培養液預平衡48 h，以消除試驗過程中容器壁的吸附作用，培養時每天充分搖瓶3～5次，并隨機交換位置以減少光照可能引起的誤差。

根據預試驗培養結果，設置100、200、400、800和1 600 μg/L 5個Cd2+濃度組，另設1個對照組（0 μg/L），每組3個平行。在暴露時間試驗中，以72 h半效應濃度（EC50）的近似值作為試驗濃度，分別于暴露后3、6、12、24、48、96 h測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，試驗重復1次。

1.3 生物效應指標測定

1.3.1 細胞密度和相對增長率（K）測定 細胞密度測定用盧戈氏液固定，采用血球計數板直接計數法在顯微鏡下進行計數，每個樣品計數3次，取平均值。相對增長率計算方法參見文獻[6]，用直線內插法[7]求得72 h EC50值。

1.3.2 類胡蘿卜素（Car）含量測定 類胡蘿卜素含量的測定參照文獻[8]，90%丙酮提取后，用日本島津UV-1600型紫外可見分光光度計測定。

1.3.3 谷胱甘肽（GSH）含量測定 谷胱甘肽含量的測定參照文獻[9]，以DTNB顯色，在412 nm下檢測。

1.3.4 SOD活性測定 粗酶液制備：取待測藻液20 mL，于5 000 r/min下離心10 min，去上清液，沉淀中加入適量0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.0），超聲波破碎藻細胞；破碎液于4 ℃ 6 500 r/min下離心20 min，上清液即為粗酶液。SOD活性測定采用Beauchamp等[10]建立、Bewley[11]改進的氮藍四唑（NBT）光化學還原反應法。反應結束后，利用日本島津UV-1600型紫外可見分光光度計在560 nm處測定吸光度，測定時用0.1 mL磷酸緩沖液代替粗酶液測得對照組吸光度。1個酶活力單位（U）定義為能引起反應初速度（不加酶時）半抑制時的酶用量。

1.3.5 抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性的測定 抗壞血酸過氧化物酶活性的測定參照文獻[12]的方法進行，以1 min氧化1 μmol抗壞血酸（AsA）的酶量為1個抗壞血酸過氧化物酶活力單位（U）。

1.3.6 丙二醛（MDA）含量的測定 MDA含量采用硫代巴比妥酸法[13，14]進行定量測定：取適量粗酶液加入到含有0.5%硫代巴比妥酸（TBA）的20%三氯乙酸溶液中，混合后于100 ℃下水浴30 min，迅速冷卻，4 000 r/min離心10 min，上清液分別于532 nm、600 nm處測定吸光度。藻細胞MDA含量的單位為μmol/個，按文獻[15]的方法計算。

1.4 數據統計分析

數據處理采用SPSS 11.0統計分析軟件，并進行t檢驗和差異顯著性分析，用Excel 2003繪圖。

2 結果與分析

2.1 Cd2+脅迫對中肋骨條藻生長的影響

由圖1可見，Cd2+脅迫下各處理組的中肋骨條藻生長均表現出明顯的抑制作用，且隨著Cd2+濃度增大微藻細胞密度的增長趨于緩慢，1 600 μg/L Cd2+處理組細胞密度48 h時比24 h時上升了5.4%，72 h時比48 h時下降了4.1%，表明中肋骨條藻在高濃度Cd2+的脅迫下出現了死亡。

由圖2可見，Cd2+脅迫下各處理組中肋骨條藻的相對增長率隨著Cd2+濃度的增大迅速降低，72 h時800 μg/L Cd2+處理組的K值為0.101，1 600 μg/L Cd2+處理組的K值為-0.035。Cd2+脅迫72 h時100 μg/L處理組K值與對照相比差異顯著（P<0.05），200 μg/L處理組K值與對照相比差異極顯著（P<0.01）。用直線內插法求得Cd2+對中肋骨條藻生長的72 h EC50為378 μg/L。研究發現，低濃度的毒物對生物非但無害而且表現為刺激生長的作用，這種現象被稱為毒物興奮效應（Hormezis）[16]。本研究結果表明，低濃度Cd2+對中肋骨條藻表現出一定的刺激效應，對藻細胞的生長有一定的促進作用。

2.2 Cd2+脅迫對中肋骨條藻中GSH和Car含量的影響

如圖3所示，隨著Cd2+濃度的升高，中肋骨條藻GSH含量逐漸升高，峰值出現在800 μg/L，其GSH含量比對照升高了68.2%（P<0.05）；當Cd2+濃度大于800 μg/L時GSH的含量又略呈下降趨勢， 但其含量仍比對照高；Cd2+濃度為1 600 μg/L時GSH含量仍然比對照升高了62.1%（P<0.05）。類胡蘿卜素的含量則隨Cd2+濃度的升高而持續下降，濃度為1 600 μg/L時類胡蘿卜素含量比對照下降了31.3%（P<0.05）。

試驗結果表明，在低濃度Cd2+脅迫下，谷胱甘肽含量被誘導升高；而在較高濃度Cd2+處理下，谷胱甘肽含量又略呈下降趨勢，但仍維持在較高水平；類胡蘿卜素的含量則隨Cd2+濃度升高逐漸下降且變化幅度不大。谷胱甘肽是生物體內普遍存在的還原性物質，其在維持膜結構的完整性、清除植物體內的活性氧和防御膜脂被自由基氧化中起關鍵作用；類胡蘿卜素既是植物體的光合色素和內源抗氧化劑，在猝滅活性氧方面同樣具有重要作用[17]。有研究認為，谷胱甘肽在抗氧化方面的作用大于類胡蘿卜素[18]，這與本試驗的結果一致，即在低濃度Cd2+作用下，谷胱甘肽的含量被誘導迅速升高。

2.3 Cd2+脅迫對中肋骨條藻SOD、APX活性的影響

由圖4可見，中肋骨條藻SOD活性隨Cd2+濃度升高的變化趨勢是在低濃度時表現出應激性上升，峰值出現在100 μg/L Cd2+濃度組，Cd2+濃度大于100 μg/L時SOD活性逐漸降低，Cd2+濃度大于400 μg/L時表現出對SOD活性的抑制效應。100 μg/L Cd2+處理組的SOD活性較對照上升了26.8%（P<0.05）；400 μg/L Cd2+處理組的SOD活性較對照降低了0.5%；而1 600 μg/L Cd2+處理組的SOD活性則較對照降低了47.9%（P<0.05）。APX的活性隨Cd2+濃度升高的變化趨勢與SOD的較為相似，但變化幅度較SOD相對平緩，峰值出現在200 μg/L Cd2+濃度組，較對照升高了18.3%（P<0.05）。與對照組相比，Cd2+濃度大于400 μg/L時APX活性開始降低，且降低速度較快，800、1 600 μg/L Cd2+處理組的APX活性較對照分別降低了17.7%（P<0.05）和38.0%（P<0.05）。結果表明，中肋骨條藻 SOD、APX活性受Cd2+脅迫的變化趨勢表現為在低濃度時應激性升高，高濃度時逐漸降低，表現出抑制效應，對Cd2+的敏感性APX較SOD低。

SOD和APX是植物體細胞重要的抗氧化酶。相關研究結果表明，在低濃度的重金屬脅迫作用下，藻類細胞的SOD活性不僅沒有下降，反而被誘導上升，說明藻細胞可以通過增加其SOD等抗氧化防御系統的能力來削弱活性氧的脅迫；在高濃度的重金屬脅迫作用下，藻類細胞的SOD活性呈逐漸降低的趨勢，表明細胞清除活性氧的能力進一步下降，進而有可能對細胞造成更大的損傷[19]。隨著Cd2+濃度的升高，APX活性先上升，然后又逐漸下降，說明低濃度的Cd2+對APX的活性有誘導作用；但當Cd2+濃度大于400 μg/L時，對APX活性則有抑制效應。Cd2+對中肋骨條藻SOD活性的作用與APX相似，即低濃度時酶活性上升，高濃度時酶活性下降。

2.4 Cd2+處理時間對中肋骨條藻SOD活性的影響

試驗將中肋骨條藻培養于378 μg/L（72 h EC50）的Cd2+培養液中，結果見圖5。由圖5可知，中肋骨條藻在暴露3 h時其SOD活性被誘導而迅速升高，是對照的2.01倍（P<0.05）；暴露6 h時SOD活性達到峰值，是對照的2.76倍（P<0.05）；但96 h時的SOD活性低于對照水平，比對照下降了29.7%（P<0.05）。對照組SOD活性隨時間變化不明顯。

用72 h EC50濃度的Cd2+處理中肋骨條藻，其SOD活性隨時間變化的關系表明，在最初的數小時內SOD活性被誘導而快速升高，隨后逐漸降低。在低濃度Cd2+脅迫下，中肋骨條藻的APX、SOD都維持較高活性（圖4），中肋骨條藻仍能維持生長（圖1、圖2）。這進一步說明Cd2+脅迫對微藻生物學效應指標的影響是由多種酶和其他活性物質共同作用的結果。單一酶的活性升高對藻類細胞無明顯的益處，相反，只要有一種酶活性顯著下降時就有可能降低細胞的抗氧化防御能力，對抗氧化防御系統產生較強的影響。

2.5 Cd2+脅迫對中肋骨條藻MDA含量的影響

由圖6可見，中肋骨條藻MDA含量隨著Cd2+濃度的升高而逐漸升高，但Cd2+濃度大于400 μg/L時MDA含量略有下降，峰值出現在400 μg/L濃度組，是對照的3.72倍（P<0.05）；1 600 μg/L處理組MDA含量為對照的3.02倍（P<0.05）。表明在Cd2+脅迫下中肋骨條藻細胞膜脂被氧化自由基所氧化，產生了大量的MDA。

生物體的膜脂過氧化程度常通過測定其氧化產物MDA的含量進行衡量，即膜脂過氧化增強，其產物MDA含量就會增加[20]。試驗結果表明，Cd2+濃度小于400 μg/L時，MDA含量與溶液中的Cd2+濃度呈正相關，而Cd2+濃度大于400 μg/L時則呈負相關關系，這與Cd2+脅迫對青島大扁藻MDA含量的影響結果一致[21]。

3 結論

Cd2+對中肋骨條藻的生長呈現明顯的劑量效應關系，Cd2+對中肋骨條藻生長的72 h EC50為378 μg/L，當Cd2+濃度大于400 μg/L時，對SOD和APX活性有抑制效應；Cd2+濃度小于400 μg/L時，MDA含量與Cd2+的濃度呈正相關關系。鑒于中肋骨條藻細胞的SOD、APX活性和MDA含量與水體中的Cd2+濃度具有明顯的相關性，因此SOD和APX活性及MDA含量是監測水體中Cd2+污染的良好生物標志物。

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（責任編輯 張利艷）