姜黃素對小鼠睪丸細胞株TM4細胞的影響

摘要：主要探討姜黃素（Curcumin，CCM）對支持細胞株TM4體外生長的影響。通過采用形態學觀察、MTT法和TUNNEL法檢測了5種不同濃度的姜黃素對小鼠支持細胞株TM4細胞生長和增殖的影響。結果表明，姜黃素抑制TM4細胞的增殖并誘導其細胞凋亡，這種作用呈劑量依賴效應，當用40 μmol/mL的姜黃素處理培養的TM4細胞時，MTT法測得的細胞生長抑制率和TUNNEL法獲得的細胞凋亡指數與對照組相比均有顯著差異。說明姜黃素在預防和治療睪丸癌方面有一定的應用價值。

關鍵詞：姜黃素（Curcumin，CCM）；小鼠TM4細胞；細胞凋亡

中圖分類號：R730.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）23-5418-03

Effects of Curcumin on TM4 Cell in Mouse Testis Sertoli Cell Line

WANG Qing-zhong

（Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology in Universities of Shandong Province / College of Bio-engineering and Agriculture， Weifang University，Weifang 261061，Shandong，China）

Abstract： The present study was mainly to investigate the effect of curcumin on the in vitro growth of TM4 cells. By morphological observation， MTT method and TUNNEL method， the action of curcumin in 5 different concentrations on TM4 cells cultured in DMEM medium were detected. The results indicated that curcumin could inhibit the growth and proliferation of TM4 cells， and induce the apoptosis of cultured TM4 cells. These effects showed dose-dependent. When the cultured TM4 cells was treated with 40 μmol/mL curcumin， the inhibitory rate of TM4 cells from MTT method and apoptosis index of TM4 cells from TUNNEL method all had significantly differences from the data of control group. These results suggested that the curcumin had application prospects in the prevention and treatment of testicular cancer.

Key words： curcumin； mouse TM4 cells； apoptosis

生姜（Zingiber officinale）是藥食同源植物，具有驅風散寒、健胃止吐、抑菌殺蟲、抗腫瘤等作用。姜黃素（Curcumin，CCM）為姜的重要活性成分之一，廣泛用于食品添加劑和著色劑，具有抗HIV、抗利什曼原蟲、抗細胞畸變、抑制血小板聚集和血栓形成等多種作用[1，2]，尤其是姜黃素的抗癌活性在近年來受到廣泛重視。研究表明，姜黃素可誘導細胞凋亡，對宮頸癌、子宮內膜癌、腎癌、乳腺癌等各種癌癥的發生有抑制和治療作用[3-11]。但關于姜黃素對精子發生和睪丸腫瘤的作用至今未見報道。TM4細胞株來源于小鼠睪丸支持細胞（Sertoli cells），在體外培養中具有支持細胞、上皮細胞和腫瘤細胞的特性。通過研究姜黃素對TM4細胞的影響，可反映其對哺乳動物和人的生精作用及對睪丸腫瘤發生的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

L-谷胺酰胺、青霉素、鏈霉素、葡萄糖、二甲基亞砜（DMSO）、胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）、DMEM、胰蛋白酶（Trypsin）、明膠、MTT（甲基四氫葉酸鹽）等試劑均購于Sigma-Aldrich公司；TUNNEL細胞凋亡檢測試劑盒為凱基生物有限公司產品，姜黃素為Acros公司產品；其他一般試劑均為國產分析純。主要儀器包括細胞培養板、細胞培養瓶（北京鼎國生物有限公司）、CO2培養箱（美國Precision Scientific Inc.）、倒置顯微鏡（日本Olympus）、An Thos TH2酶標儀（Austria公司）等。

1.2 細胞株與培養條件

小鼠支持細胞系TM4細胞株由中國科學院動物研究所生殖生物學重點實驗室惠贈。

細胞培養基是以DMEM為基本培養液，添加 2 mmol/L谷氨酰胺、5% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。細胞培養在37 ℃、5% CO2和飽和濕度條件下進行。0.25%的胰蛋白酶消化傳代。細胞單層貼壁生長，選擇對數生長期細胞進行試驗。將TM4細胞株分為對照組和試驗組。試驗組以5種不同濃度的姜黃素進行處理。

1.3 姜黃素儲存液的配制與保存

姜黃素儲存液：稱取姜黃素113.4 mg，加入DMEM細胞培養液10 mL，混勻溶解后過濾除菌，分裝并于 -20 ℃保存。用前以溫水浴解凍，以細胞培養液稀釋至所需濃度。

1.4 MTT比色法檢測TM4細胞活性

MTT能被活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan），而死細胞無此功能。DMSO能溶解甲瓚，用酶標儀在490 nm波長處測定其吸光度值，可間接反映活細胞數量。在一定活細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。

用0.25%胰蛋白酶消化對數生長期的TM4細胞，制成5×104個/mL細胞懸液，以每孔200 μL接種于96孔板，置培養箱中培養24 h后，棄掉培養基，依次以終濃度為20、40、60、80、100 μmol/mL的姜黃素培養液分別加入96孔板的各孔內，每一濃度設5個平行。同時設對照組（不加姜黃素）及空白組（僅加培養液）。繼續培養48 h后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，培養箱中孵育4 h，然后吸出孔內培養液，每孔加入DMSO液200 μL，將培養板置于微孔振蕩器上振蕩10 min，使結晶物溶解，最后在酶標儀上于490 nm波長下測定各孔的OD490 nm值。通過下列公式計算細胞存活率和抑制率。

細胞存活率=[（對照組OD490 nm-試驗組OD490 nm）/（對照組OD490 nm-空白組OD490 nm）]×100%；抑制率=100%-存活率。

試驗重復3次取平均值。結果用SPSS 10.0統計分析軟件進行t檢驗及數據處理，以P<0.05表示差異有統計學意義。

1.5 原位末端標記法（TUNNEL）檢測TM4細胞凋亡

TM4細胞的處理同上，所不同的是制作成細胞爬片，載玻片常規干熱滅菌處理，用前以0.2%明膠包被10 min，然后用PBS洗滌3次后接種細胞。細胞的染色按試劑盒說明書進行，主要步驟如下：①取出細胞爬片，PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌2次，每次5 min；②加入3%過氧化氫室溫下孵育20 min，PBS洗滌3次，每次5 min；③0.1%蛋白酶K在4 ℃下作用30 min，PBS洗滌3次，每次5 min；④加入反應混合液，37 ℃濕盒內孵育60 min，PBS洗滌3次，每次5 min，然后加50 μL POD，繼續孵育60 min，PBS洗滌3次，每次5 min；⑤加入50 μL新配制的DAB顯色試劑作用3～5 min，用自來水洗，置顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 光鏡下檢查姜黃素對TM4細胞增殖的影響結果

光鏡下，對照組的TM4細胞呈上皮樣貼壁生長良好，形態呈梭形或多角形，胞核明顯（圖1A）。20 μmol/mL的姜黃素處理組的TM4細胞形態結構沒有明顯變化；40 μmol/mL的姜黃素處理組可觀察到細胞生長不良，某些細胞的胞體變小，變圓，貼壁細胞數目減少（圖1B）；60 μmol/mL的姜黃素處理組中可觀察到大量的細胞脫壁，輪廓不清晰，細胞膜破潰，聚集成細胞團以及少量的細胞碎片（圖1C）。可見隨處理劑量的增加，姜黃素可明顯抑制TM4細胞的生長與增殖。

2.2 MTT法檢測姜黃素對TM4細胞增殖的影響結果

MTT法測定不同濃度的姜黃素對TM4細胞株生長與增殖的影響結果見表1。由表1可見，20 μmol/mL姜黃素處理的TM4細胞抑制率與對照組相比沒有顯著差異，40 μmol/mL姜黃素處理組對TM4細胞增殖的抑制作用與對照組相比有顯著差異（P<0.05），隨著姜黃素處理濃度的增大，其抑制作用越來越強，呈劑量依賴性。姜黃素處理濃度達到100 μmol/mL時，TM4細胞的生長與增殖已基本被抑制。

2.3 TUNNEL法檢測姜黃素對TM4細胞的影響結果

通過試驗檢測發現，姜黃素具有誘導TM4細胞凋亡的作用。在20 μmol/mL姜黃素處理下偶見凋亡的細胞，說明該濃度的姜黃素處理對TM4細胞沒有明顯影響（圖2B）；40 μmol/mL姜黃素處理下可觀察到較多的凋亡細胞，隨著處理濃度的增加，凋亡細胞的比例逐漸增大（圖2C）。統計分析也表明，40 μmol/mL姜黃素處理組與對照組相比其TM4細胞凋亡指數有顯著差異（P<0.05）（表2）。

3 小結與討論

從生姜中提取的姜黃素具有多方面的藥理作用。尤其是作為一種具有良好發展前景的抗癌新藥，具有抗癌譜廣、毒副作用小的優點，被認為是潛在的第三代抗惡性細胞增殖藥[4-11]。許多研究表明，姜黃素具有確切的抗細胞增殖活性[2，8]，但姜黃素對睪丸中支持細胞和生精細胞的影響作用還鮮見報道。

在本研究中，利用小鼠睪丸支持細胞株TM4作為研究材料，通過光鏡下的細胞形態觀察、MTT法測定細胞活性和TUNNEL法三種方法研究姜黃素對TM4細胞的影響。結果表明姜黃素可抑制TM4細胞的增殖，誘導TM4細胞凋亡。這一結果與報道的姜黃素對其他類型細胞的影響結果是一致的，40 μmol/mL的姜黃素即能顯著抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡[2-8]，并呈劑量依賴效應。TM4細胞來源于小鼠的睪丸支持細胞，既具有支持細胞的特殊性，又具有腫瘤細胞的特點。這一研究結果也表明，姜黃素對睪丸癌細胞的增殖有抑制和誘導其凋亡的作用。因此，姜黃素可以作為預防和治療睪丸癌的藥物。但姜黃素誘導睪丸細胞凋亡的詳細機制還有待于進一步的研究。

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