產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌O60B1的分離及鑒定

摘要：從曼地亞紅豆杉（Taxus x media）樹(shù)皮內(nèi)表皮中分離得到1株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌O60B1，并通過(guò)高效液相色譜法（HPLC）和質(zhì)譜法（MS）分析其發(fā)酵產(chǎn)物，其紫杉醇產(chǎn)量為2.5～3.0 μg/g（紫杉醇/菌絲干重），并通過(guò)形態(tài)學(xué)特征和18 S rDNA序列分析，將其初步鑒定為毛霉屬（Mucor sp.）真菌。

關(guān)鍵詞：紅豆杉（Taxus x media）；紫杉醇；內(nèi)生真菌；18 S rDNA；毛霉（Mucor sp.）

中圖分類號(hào)：S459 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2012）23-5315-03

Isolation and Identification of A Taxol-producing Endophytic Fungus O60B1

ZHANG Peng1，2，LIU Bo2，XU Man2，AO Ming-zhang2，F(xiàn)U Chun-hua2，YU Long-jiang2，GU Yu-cheng1

（1. Institute of Industrial Crops， Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China； 2. Institute of Resource Biology and Biotechnology， College of Life Science and Technology， Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430074，China）

Abstract： A taxol-producing endophytic fungus O60B1 was isolated from the inner bark of Taxus x media. It could produce 2.5～3.0 μg taxol per one gram dry weight of mycelium according to determination of high performance liquid chromatography（HPLC） and mass spectrometry（MS）. The fungus O60B1 was defined as Mucor sp. through morphological observation and 18 S rDNA sequence analysis.

Key words： Taxus x media； taxol； endophytic fungi； 18 S rDNA； Mucor

紫杉醇是最先分離自紅豆杉的高效抗腫瘤藥物[1，2]。但由于紅豆杉資源稀缺，直接從紅豆杉植物中提取紫杉醇無(wú)法滿足市場(chǎng)需求，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇是解決紫杉醇藥源緊缺問(wèn)題的有效途徑之一[3-6]。目前已有30多種產(chǎn)紫杉醇真菌被報(bào)道，但大多數(shù)真菌的紫杉醇產(chǎn)量都較低，無(wú)法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)[3-5]。除了通過(guò)基因工程或誘變等手段提高已發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生真菌的紫杉醇產(chǎn)量外，人們?nèi)栽诜e極地從自然界中篩選紫杉醇高產(chǎn)菌株。

本研究從曼地亞紅豆杉樹(shù)皮內(nèi)表皮中篩選得到1株產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌O60B1，并通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和18 S rDNA序列分析將其鑒定為毛霉屬（Mucor sp.）真菌，為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇提供了具有潛在應(yīng)用價(jià)值的新菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

曼地亞紅豆杉樹(shù)皮樣品采自華中科技大學(xué)校園苗圃。真菌分離及培養(yǎng)用培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基（Potato dextrose agar）和PDL（Potato dextrose liquid）培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基為YES培養(yǎng)基[7]。紫杉醇標(biāo)樣購(gòu)自Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離與純化 內(nèi)生真菌的分離和純化參照已報(bào)道的方法[7，8]，經(jīng)純化后的內(nèi)生真菌接種于PDA斜面保存于4 ℃冰箱。

1.2.2 紫杉醇的提取及HPLC-MS分析 內(nèi)生真菌紫杉醇的提取及高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）和質(zhì)譜法（Mass spectrum，MS）分析參照已建立的方法[7-9]。HPLC分析的色譜儀為Agilent 1200 HPLC System。質(zhì)譜分析由華中科技大學(xué)分析測(cè)試中心完成，儀器為Agilent 1100 LC/MSD trap。

1.2.3 真菌形態(tài)觀察 將內(nèi)生真菌菌株于PDA斜面活化2～3代后，接種于PDA培養(yǎng)基平板，25～28 ℃培養(yǎng)2周，觀察其菌落的形態(tài)特征和生長(zhǎng)情況，包括菌落形狀、生長(zhǎng)速度、表面特征以及產(chǎn)生孢子體的能力等；并采用水浸制片法觀察，即在載玻片上滴加1滴去離子水，用解剖針從平板上挑取少量帶有孢子的菌絲，放入水滴中并輕輕用解剖針將菌絲分散，蓋上蓋玻片后，在顯微鏡下觀察菌絲特征，包括菌絲體的粗細(xì)、有隔和分枝情況、顏色等，以及分生孢子體的特征，如大小、性狀、色澤等。

1.2.4 18 S rDNA序列分析 將內(nèi)生真菌接種在20 mL PDL培養(yǎng)基中，28 ℃、100 r/min培養(yǎng)3～5 d后收集菌絲，并采用上海雷浩信息科技有限公司的 Sp fungal DNA kit提取其基因組DNA，18 S rDNA序列的擴(kuò)增引物為18S-F1（5′-GATCCTGCCAGTAGT

CATATGC-3′）和18S-ITS2（5′-GCTGCGTTCATCGA

TGC-3′），擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)[7]。引物合成和核酸測(cè)序由上海桑尼生物科技有限公司完成，測(cè)序結(jié)果通過(guò)Blast在線比對(duì)分析（http：//blast. ncbi. nlm.nih.gov/Blast）。

2 結(jié)果與分析

將12塊曼地亞紅豆杉樹(shù)皮的內(nèi)表皮接植于PDA平板，培養(yǎng)過(guò)程中不斷分離新長(zhǎng)出的內(nèi)生真菌，最終經(jīng)分離、純化獲得菌落形態(tài)及生長(zhǎng)周期不同的內(nèi)生真菌20株，分別將其接種到300 mL的真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃、180 r/min培養(yǎng)10 d后，收集菌絲并提取其紫杉醇進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果（圖1）表明，紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間約為10.3 min，菌株O60B1的提取物在此保留時(shí)間也有明顯的特征峰，且與標(biāo)樣的保留時(shí)間基本一致（10.2 min），初步確定該真菌可產(chǎn)紫杉醇，紫杉醇產(chǎn)量約為2.5～3.0 μg/g（紫杉醇/菌絲干重）。進(jìn)一步對(duì)內(nèi)生真菌O60B1的紫杉醇提取物進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果（圖2）表明，以Na+轟擊后，內(nèi)生真菌O60B1紫杉醇提取物具有和紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品一樣的特征峰（（M+Na）+=876）[10]，質(zhì)譜分析結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了內(nèi)生真菌O60B1可以生產(chǎn)紫杉醇。

內(nèi)生真菌O60B1在25～28 ℃溫度下在PDA平板上生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)2 d后菌落直徑約為4.6 cm （圖3A），初生菌絲為白色，在成長(zhǎng)過(guò)程中菌絲逐漸變成淺灰色。菌絲粗大，無(wú)明顯的隔、多核，分枝較少（圖3B）。孢囊梗單生，直立，頂端著生橢球形孢子囊（圖3C）。可觀察到兩種形態(tài)的孢子（圖3D-F）：孢囊孢子為白色橢圓形孢子，表面光滑（圖3D）；另外一種孢子為黃褐色橢形孢子，較大，推測(cè)為接合孢子或者厚垣孢子（圖3E-F）。根據(jù)內(nèi)生真菌O60B1的形態(tài)觀察，對(duì)照《真菌鑒定手冊(cè)》[11]，發(fā)現(xiàn)其與毛霉屬菌極為相似。

此外，也對(duì)內(nèi)生真菌O60B1進(jìn)行了初步的分子鑒定，提取其基因組DNA（圖4A）后進(jìn)行18 S rDNA擴(kuò)增，結(jié)果表明：獲得1條約2.0 kb大小的擴(kuò)增片段（圖4B）；序列分析結(jié)果表明，產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌O60B1的18 S rDNA序列與毛霉菌（Mucor sp. EIM-10）的18 S rDNA序列（GenBank No. EU793999.1）有95%一致性；與毛霉菌（Mucor plumbeus strain UPSC 1492）的18 S rDNA序列（GenBank No. AF548078.1）有95%一致性。因此，根據(jù)其形態(tài)特征和18 S rDNA序列分析結(jié)果，初步將O60B1鑒定為毛霉菌屬（Mucor sp.）真菌。

3 討論

由于紫杉醇藥源植物紅豆杉天然資源有限且紫杉醇含量極低，限制了紫杉醇在臨床和科研上的廣泛應(yīng)用。1993年人們首次從太平洋短葉紅豆杉（Taxus brevifolia）分離到產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌-安德魯紫杉菌（Taxomyces andreanae）[12]，為人們展示了一條利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇的新的藥源途徑。由于微生物具有生長(zhǎng)迅速、易培養(yǎng)、發(fā)酵周期短、生產(chǎn)成本低、易于通過(guò)誘變或者基因工程手段迅速提高其紫杉醇產(chǎn)量等優(yōu)點(diǎn)，因此，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇成為解決紫杉醇藥源緊缺的有效途徑之一。但目前發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的紫杉醇產(chǎn)量都很低，仍不適合工業(yè)化應(yīng)用。本研究從曼地亞紅豆杉中分離獲得1株紫杉醇產(chǎn)量為2.5～3.0 μg/g的內(nèi)生真菌O60B1，并將其初步鑒定為毛霉菌屬真菌。該菌株雖然紫杉醇產(chǎn)量較低，但其生長(zhǎng)迅速，是1株具有潛在應(yīng)用價(jià)值的產(chǎn)紫杉醇真菌。本實(shí)驗(yàn)室希望通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件，以及通過(guò)誘變育種或基因工程技術(shù)對(duì)其進(jìn)行遺傳改造，提高其紫杉醇產(chǎn)量，為微生物發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇提供新的菌種。

參考文獻(xiàn)：

[1] WANI MC， TAYLOR HL， MONROC F， et al. Plant antitumor agent VI： The isolation and structure of taxol， a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia[J]. J Am Chem Soc，1971，93：2325-2327.

[2] MCAULIFFE G， ROBERTS L， ROBERTS S. Paclitaxel administration and its effects on clinically relevant human cancer and non cancer lines[J]. Biotechnol Lett，2002，24：959-964.

[3] JI Y， BI JN， YAN B， et al. Taxol-producing fungi： a new approach to industrial production of taxol[J]. Chinese J Biotechnol，2006，22：1-6.

[4] ZHOU X， ZHU H， LIU L， et al. A review： recent advances and future prospects of taxol-producing endophytic fungi[J]. Appl Microbiol Biotechnol， 2010，86：1707-1717.

[5] 康冀川，靳 瑞，雷邦星，等.內(nèi)生真菌產(chǎn)紫杉醇研究的回顧與展望[J]. 菌物學(xué)報(bào)，2011，30（2）：168-179.

[6] 馬玉超， 趙 凱， 王世偉， 等. 產(chǎn)紫杉醇（Taxol）內(nèi)生真菌的生物多樣性[J].菌物研究，2003，1（1）：28-32.

[7] 張 鵬，劉 博，周蓬蓬，等.一株產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌YN6的分離及鑒定[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2011，27（10）：961-967.

[8] ZHANG P， ZHOU P P， JIANG C， et al. Screening of taxol-producing fungi based on PCR amplification from Taxus[J]. Biotechnol Lett， 2008，30：2119-2123.

[9] ZHANG P， ZHOU P P， YU L J. An endophytic taxol-producing fungus from Taxus media， Cladosporium cladosporioides MD2[J]. Curr Microbiol，2009，59：227-232.

[10] STIERLE A， STROBLE G， STIERLE D. Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae，an endophytic fungus of Pacific yew[J].Science，1993，260（5105）：214-216.

[11] 魏景超. 真菌鑒定手冊(cè)[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1982. 58-74.

[12] STROBEL G A， STIERLE A， STIERLE D et al. Taxomyrces andreanae， a proposed new taxon for a bulbilliferous hyphomycete associated with Pacific yew（Taxus brevifolia）[J].Mycotaxon， 1993，47：71-78.

（責(zé)任編輯 張 毅）