代謝組學在煙草香味物質研究中的應用概況與展望

摘要：概述了代謝組學的技術手段及代謝組學在煙草（Nicotiana tabacum）香味物質研究中的應用現狀，并展望了代謝組學在煙草香味物質研究領域的發展趨勢。

關鍵詞：煙草（Nicotiana tabacum）；代謝組學；香味物質；交叉研究

中圖分類號：TS41+1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）23-5248-05

Review and Prospect of Metabonomics in the Research of Tobacco Aroma Composition

FENG Ji，YU Jun，CAI Chang-chun

（Research Center of Tobacco Biotechnology Engineering， Hubei Tobacco Research Institute， Wuhan 430030， China）

Abstract： Metabonomics， developed from the late 20th century， is a new discipline comprehensively researching on all metabolites in organisms. It is to analyze qualitatively and quantitatively and reveal the mechanism of metabolism in organisms. Although metabonomics has been developing rapidly in recent decades， the application of metabonomics on research of tobacco （Nicotiana tabacum） aroma composition is still in the primary stage. The technical methods and progress on aroma composition in tobacco were reviewed； and the prospects of the application of metabonomics on the research of tobacco aroma composition were looked forward.

Key words： tobacco（Nicotiana tabacum）； metabonomics； aroma composition； crossed research

隨著煙草基因組測序的完成（測序品種為野生種絨毛狀煙草Nicotiana tomentosiformis、林煙草N. sylvestris和栽培種紅花大金元N. tabacum），人們逐漸從煙草結構基因組學（以建立高分辨率的遺傳和物理圖譜為主）向煙草功能基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學過渡。代謝組學（Metabonomics）是繼轉錄組學和蛋白質組學之后發展起來的一門新興學科，是系統生物學的重要組成部分。代謝組學的概念來源于代謝組，而要了解代謝組則必須先了解代謝（Metabolism）和代謝物（Metabolite）。代謝是指生物體內所發生的用以維持生命的一系列有序的化學反應總稱。在代謝過程產生或消耗的小分子物質（分子質量1 000 u以內）叫做代謝物，不包括生物大分子物質。因此，代謝物的分析是從分子水平上研究生物體生命活動的一個重要突破口。代謝組學是以組群指標分析為基礎，以高通量檢測和數據處理為手段，以信息建模與系統整合為目標，對某一生物或細胞在一特定生理時期內所有代謝物進行定性和定量分析的一門新學科[1]。

煙草中的香味物質是以煙草植株體內初生代謝前體物為原料，經一系列酶的催化作用發生生理生化反應所形成的一類次生代謝產物。目前從煙葉組織中已鑒定出的代謝物有3 000多種，其中與香味有關的代謝物有700余種[2]。這些香味物質的分子里含有羥基、巰基等特定致香功能基團，使煙葉組織散發出令人愉悅舒爽的香味。按照特定致香功能基團不同，煙草香味物質可分為有機酸類、酚類、脂質類、甾醇類、萜類、雜環類等代謝物[3]。如此種類繁多的煙草香味代謝物給研究帶來了一定的困難。然而利用代謝組學的技術手段，將這數百種不同種類的香味物質作為一個整體研究對象，通過高通量的分析儀器進行檢測，對所獲得的大量數據進行相應的整合處理，從中了解和掌握煙草中所有香味物質代謝變化規律，可有效地判斷和預測煙草香味物質的代謝變化，為培育不同香型煙草品種服務。因此，將代謝組學研究技術應用于煙草香味物質研究中是十分必要的[4]。

1 代謝組學的技術原理

代謝組學研究技術具有高靈敏度、高通量和無偏向性等特點。近紅外光譜（Near infrared spectroscopy，NIR）分析技術是近年來代謝組學研究領域快速發展的一種高效分析技術，該技術是將一束不同波長的紅外射線照射到標準樣品上，某些特定波長的紅外射線被樣品吸收而形成該樣品的紅外吸收光譜，然后利用近紅外光譜所反映的樣品基團、組成或物態等信息構建校正模型，以此來實現對未知樣品的定性或定量分析。在煙草香味物質研究中，研究人員收集數百份具有代表性樣品的光譜數據，以此建立相應指標的近紅外模型用于測定煙草重要香味成分。研究結果表明，近紅外光譜分析技術作為一種簡便、高效、低消耗的綠色分析技術用于測定煙草中重要香味物質成分是可行的[5，6]。然而，該技術需要大量有代表性樣品建立模型，同時需要根據儀器的改變或標準樣品變化不斷更新模型，這些因素大大縮小了近紅外光譜分析技術的使用范圍。

色譜法是另一種高效的分析手段，具有高分辨能力、高靈敏度和高分析速度等特點，是分析復雜混合代謝物的主要手段[7]。但是在進行定性和定量分析時，由于色譜法主要依據保留的出峰值，很難對那些未知復雜的代謝物做出定性分析，因此需要借助于其他儀器進行輔助分析。而質譜分析法是一種將分子電離成不同的帶電荷離子，然后按質荷比將其分離和檢測，從而推斷分子結構的分析方法[8]。雖然質譜分析法具有很強的結構分析和鑒定能力，但是這種方法只能夠對單一的組分給出良好的定性結果，對那些復雜混合的代謝物不具備分離解析能力。因此，色譜與質譜聯用技術既可以發揮色譜法和質譜法各自的優勢，同時也相互彌補了各自的不足。氣相色譜與質譜聯用技術（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）于1957年首次得以實現[9]，并且得到迅速的發展。該方法主要適合于復雜的混合代謝物中未知組分的定性分析，判斷代謝物的分子結構。這種方法靈敏度高，分析速度快，重復性好，但不足之處是對樣品中難揮發或是極性較大的代謝物進行分析之前，需要將樣品經過衍生化處理。液相色譜與質譜聯用技術（Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）可以很好地解決這個問題[10]。與GC-MS相比，LC-MS更適合于分析那些沸點高、分子大、熱穩定差或極性強的代謝物。在已知的植物代謝物中大約70%的代謝物是不揮發的，因此LC-MS比GC-MS有更加廣闊的應用前景。但是LC-MS和GC-MS各有所長，應相互補充。目前在煙草的香味物質分析研究中，GC-MS的應用較廣泛，大部分煙草香味物質是由GC-MS分析技術檢測出來的[11]。

2 代謝組學在煙草香味物質研究中的應用

2.1 煙草香味物質成分的鑒定

在20世紀五六十年代，科研人員就著手對煙草香味物質成分進行分離檢測，但由于分離檢測技術手段的限制，相關研究未能取得實質性突破，人們對煙草香味物質的認識始終停留在初級水平。隨著氣相色譜、液相色譜、質譜等代謝組學研究技術的發展和普及，使得科研人員能夠在高通量水平上對煙草香味物質成分進行分離、鑒定以及相應研究。1976年，Lloyd等[12]借助蒸餾萃取技術從烤煙煙葉和煙絲中提取出香精和精油，并將它們分成若干組分，利用GC-MS技術并結合近紅外、核磁共振等技術，對香精和精油中香味物質進行了研究，分離鑒定出羧酸類、醇類、醛類、脂類等共計12類323種代謝物（香精中含有195種，精油中含有228種），其中275種是在烤煙中首次發現的，132種未在其他類型煙草中被發現。Demole[13，14]等采用水蒸氣蒸餾、溶劑提取和真空蒸餾技術對白肋煙中的揮發性和半揮發性香味物質進行提取，通過GC-MS技術對提取物進行檢測分析，共鑒定193種代謝物，其中81種代謝物首次在煙草中被鑒定，確定大馬酮和二氫大馬酮為重要的香味物質。Schumacher[15]以馬里蘭煙為研究材料，利用GC-MS技術對其提取液進行檢測分析，鑒定出142種馬里蘭煙香味物質，并將這些香味物質與烤煙、白肋煙的香味物質進行比較分析。

我國對煙草香味物質成分分離檢測研究起步較晚，但近20年我國科研人員檢測煙草香味物質成分的研究也取得了較大的進展，分離鑒定出一批與煙草香氣有關的代謝物。劉百戰等[16]借助頂空分離法從不同部位、成熟度及顏色的云南烤煙中提取香味物質，并利用毛細管氣相色譜技術對提取液進行測定分析，共檢測到14種香味物質。謝劍平等[17]采用蒸餾萃取技術從國產（湖北鶴峰、重慶奉節）和進口（巴西、津巴布韋和馬拉維）白肋煙煙葉中提取出香味物質，用GC-MS技術對提取液中的酸性、堿性和中性香味物質進行了分析，總共鑒定出200種香味物質，其中有30種代謝物在煙草香味物質研究中尚未報道。吳新華等[18]采用超高效液相色譜-電噴霧串聯四極桿質譜（UPLC-ESI-MS/MS）技術并在多反應離子監測（MRM）模式下，分離測定了7種煙草的香味物質。

利用代謝組學技術對煙草香味物質成分的鑒定研究，在很大程度上提高了對煙草香味物質的認識，證實了不同香型煙草間的香味物質成分存在顯著的差異[19]。代謝組學研究技術為煙草香味物質研究提供了一種準確客觀的檢測技術，為今后深入研究不同煙草類型間、不同品種間、不同地方種植同一品種間主要香味物質的差異及其形成原因提供了可能的手段。

2.2 不同基因型煙草香味物質的比較

在影響煙草香味物質合成與積累的因素中，基因型是最重要的因素，它可通過煙草體內基因表達調控直接影響煙葉的香味[20]。如煙草品種的基因型存在缺陷，無論采取怎樣的栽培技術和其他措施，其體內不產生或合成較少香味物質，導致該煙草的香氣質和量上都存在不足。因此，要獲得香氣品質優良的煙草品種，必須鑒別區分不同基因型煙草材料之間的香味物質差異，對評價篩選優良特色煙草材料有重要作用。常愛霞等[21]利用蒸餾萃取以及GC-MS技術對特香型烤煙、香料煙和烤煙3種類型的煙葉進行了揮發性致香成分的檢測分析，發現特香型烤煙與烤煙的差異相對較小，而與香料煙存在著較大差異。汪耀富等[22]采用GC-MS技術對中國推廣種植的5個不同基因型烤煙品種的香味物質含量進行了比較分析，證明不同基因型烤煙葉片間香味物質的含量差異較大。席元肖等[23]應用LC和GC-MS技術，對中國18個產區68個產煙縣的初烤煙葉樣品的香味物質進行代謝組學分析。結果表明香型烤煙的葉黃素、類胡蘿卜素、新綠原酸、蕓香苷等共13種香味物質的含量顯著較高；濃香型烤煙的綠原酸、香葉基丙酮、苯乙醛、苯甲醛、巨豆三烯酮等共7種香味物質的含量顯著較高；中間香型烤煙大部分香味物質含量居中。因此，基因型對目標香型烤煙品種的選育有十分關鍵的影響。

2.3 不同生態環境煙草香味物質的比較

煙草中香味物質合成與積累易受外界環境影響，光照、溫度、水分、海拔、氣候等因素是影響煙草香味物質的重要因素[24]。因此，監測不同環境中的煙草香味物質的變化，可以了解不同的外界環境對煙草體中香味物質合成與積累的影響。楊興有等[25]使用NIR、HPLC和GC-MS分析技術對不同光照處理過的烤煙材料進行分析。研究結果顯示，中性香味物質總量隨光照減弱而明顯增加，但當光照減弱到一定程度，中性香味物質又開始減少。水分是煙草生長發育不可或缺的條件，但降水量和土壤中水分含量對煙草煙葉香味物質的影響卻是相反。例如采用HPLC分析技術對煙草葉片的香味物質進行分析，研究發現增加田間灌水量能顯著提高煙草葉片產生香味物質，而降雨則能淋洗大量煙葉表面脂溶性香氣物質[26，27]。楊虹琦等[28]采用HPLC分析技術對來自于云南、貴州、福建、河南、黑龍江5省共10個地區的煙葉材料進行分析。研究表明，隨著緯度的降低和海拔高度的升高，烤煙中類胡蘿卜素含量逐漸升高。

2.4 不同栽培與調制方式煙草香味物質的比較

不同栽培措施對煙草中香味物質合成與積累影響較大，只有根據各煙區自身的環境條件，找到合適的栽培方式，最大限度地發揮各煙區的自然優勢，使各煙區煙葉具有不同風格特色的香味。例如煙草種植密度和葉片數影響著煙葉中性香味物質的含量。因此，趙銘欽等[29]采用GC-MS分析技術在延邊煙區對種植密度和留葉數不同的煙草進行檢測分析。結果表明，不同種植密度和留葉數對煙葉中性致香物質含量的影響不同，其中當密度為120 cm×50 cm、留葉數為18片/株時，煙葉中性香味物質含量最高，香氣質量較好，適宜在延邊煙區生產中推廣應用。

煙葉調制過程是香味物質前體物降解、香味物質形成和轉化的主要時期。因此探索優化調制過程中的條件，最大限度促使煙葉內香味物質前體物大量轉化，使得更多的特色香味物質彰顯出來。Weeks等[30]運用GC-MS技術分析發現煙葉在調制過程中香味物質新植二烯含量顯著增加，但陳化時間過長，其含量則下降，表明新植二烯可發生進一步代謝反應。宮長榮等[31]利用GC-MS技術研究不同烘烤條件下的煙葉香味物質含量，認為以低溫慢烤煙葉中香氣物質損失較少，內在品質較好。

2.5 代謝組學與其他學科的交叉應用

隨著各個學科研究的深入，科學家們逐漸認識到基因組、表達組和蛋白質組水平上的變化不一定能夠對煙草香味物質產生實質的影響。而煙草體代謝產生的代謝產物才是煙草體中新陳代謝的最終結果，能夠準確反映煙草體中狀態，因此只有將各個學科所獲得的相關信息聯系起來，才能從整體水平研究煙草香味物質對環境變化的響應[32]。任何單一方面的研究對煙草香味物質的理解都是不全面的，因此煙草代謝組學與其他學科的交叉研究是必然趨勢。

將代謝輪廓分析與遺傳學、基因組學結合在一起展開研究，是煙草代謝組學與遺傳學、基因組學交叉領域新興的研究方向。常愛霞等[33]采用蒸餾萃取和GC-MS分析技術，對有特殊香氣大白筋599和具有一般香氣的G28烤煙煙葉進行全面代謝輪廓分析，共檢測到67種香味物質，其中55種為二者共有，且大白筋599有25種香味物質含量高于G28。剩下12種香味物質為品種特有，其中8種為大白筋599所特有，4種為G28所特有。進一步的遺傳分析表明大白筋599的特異香味物質是由單顯性基因所控制。另外，有人采用代謝組學與基因組學研究方法對香料煙香味物質進行研究，發現香料煙特征性香味物質是雪松-琥珀香，該代謝物受一個位于A染色體上的基因控制[34]。

由于煙草中大多數香味物質的含量較低，通過育種工程增加某類物質的含量需要漫長時間且效果也不明顯，無法在短期內快速有效地改善煙草的香味品質。因此，通過基因工程技術將某些特定的基因導入煙草基因組內或使用農桿菌轉化煙草而獲得轉基因植株，可以快速有效提高煙草的香味品質[35]。李雪君等[36]采用GS-MS分析技術，對轉法呢基焦磷酸合酶（Farnesyldiphosphatesynthase，FPS）基因煙草株系（K-4、K-6、K-17、K-35）和未轉基因對照的烤后煙葉中類胡蘿卜素含量及萜烯類香味物質含量進行分析，研究發現與未轉基因對照相比，轉基因煙草株系烤后煙葉中8種類胡蘿卜素降解產物及茄酮、新植二烯含量都有不同程度的提高，結果表明外源FPS基因在煙草中的表達對煙草香味物質的合成具有促進作用，有利于煙葉品質的提高。

結合細胞生物學研究方法，利用植物細胞培養技術獲得高產細胞系，通過調節培養基、激素、光照、溫度、脅迫因子等培養條件對培養的細胞系進行處理，最終應用代謝組學研究技術得到穩定可靠的試驗數據。Chappeil等[37]采用GC-MS分析技術對處理過的煙草懸浮細胞和未處理對照的細胞培養液進行分析，結果認為向煙草懸浮細胞中加入真菌細胞壁碎片后會導致細胞培養液中香味物質倍半萜產物的積累增加。

3 展望

代謝組學是進行煙草香味物質研究的主要手段之一，目前在煙草香味物質的檢測分析以及相關基因功能的研究等方面取得了很大的成功。但從總體來看，代謝組學在煙草香味物質研究中的應用仍然處于發展階段，在方法學和應用兩方面均面臨著極大的挑戰。

在方法學研究方面，煙草香味物質的復雜性使得研究人員對分析技術的靈敏度、分辨率、動態范圍和通量提出了更高的要求[38]。代謝組學研究的深入得益于分析技術的不斷發展，如高分辨質譜、超高效液相色譜與質譜聯用、毛細管液相色譜與質譜聯用和多維核磁共振技術等的使用，為代謝組學在煙草香味物質研究中的應用提供了更加廣闊的空間。但是由于缺乏可通用的標準數據庫，一定程度上限制了這些技術在煙草香味物質研究中的應用范圍。因此完善的煙草香味物質數據庫的構建及相應研究的標準化等越來越受到關注。在應用方面，如何從大量的煙草香味物質中找出特異性的香味物質（特別是低豐度的香味物質）是煙草代謝組學發展的瓶頸。能否克服此瓶頸是決定此技術能否廣泛應用的一個重要因素。

由于煙草代謝組學存在著這些制約因素，將煙草代謝組學與其他學科整合交叉研究，并且相互驗證，是學科發展的必然趨勢。目前的研究均是將其他組學兩兩結合起來研究，如將其他學科全部結合成為一個有機體對煙草香味物質進行研究，將會使煙草香味物質的研究提升到一個前所未有的深度。如“煙草基因組計劃”（我國《煙草行業中長期科技發展規劃綱要（2006-2020年）》中確定的9個科技重大專項之一）將大規模開展煙草基因組測序和全基因組序列圖譜的繪制、揭示基因表達調控的機制、闡明蛋白質組分的表達及功能模式、探索代謝產物變化規律及構建相應的代謝調控網絡等，以實現煙草基因組、轉錄組、蛋白質組和代謝組等數據的整合，建立全面系統的煙草生物信息學數據庫，提高對煙草復雜生物學調控網絡的認識，這也是未來煙草香味物質研究的重要趨勢[39，40]。

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（責任編輯 王貴春）