藥用植物草珊瑚ＡＦＬＰ反應(yīng)體系的建立

摘要：從草珊瑚（Ｓａｒｃａｎｄｒａ ｇｌａｂｒａ）的幼嫩葉片中提取基因組ＤＮＡ，建立草珊瑚ＡＦＬＰ反應(yīng)體系，對ＡＦＬＰ反應(yīng)體系中模板ＤＮＡ的濃度、基因組ＤＮＡ的雙酶切時間、預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物的稀釋倍數(shù)和引物組合的篩選等關(guān)鍵因素進(jìn)行摸索。優(yōu)化的草珊瑚ＡＦＬＰ反應(yīng)體系為模板ＤＮＡ的用量２０ ｎｇ／μＬ、酶切反應(yīng)時間４ ｈ、預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋１５倍，初步篩選出８對較為適合草珊瑚ＡＦＬＰ分析的引物組合。

關(guān)鍵詞：草珊瑚（Ｓａｒｃａｎｄｒａ ｇｌａｂｒａ）；ＡＦＬＰ反應(yīng)體系；建立

中圖分類號：Ｓ５６７．２３＋９ 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）17－3879-03

Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ＡＦＬＰ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｓａｒｃａｎｄｒａ ｇｌａｂｒａ

ＴＡＮＧ Ｍｅｉ－ｑｉｏｎｇ，ＹＡＯ Ｓｈａｏ－ｃｈａｎｇ，ＬＩ Ｌｉｎ－ｘｕａｎ，ＬＡＮ Ｚｕ－ｚａｉ，ＬＩＮＧ Ｚｈｅｎｇ－ｚｈｕ

（Ｇｕａｎｇｘｉ Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｇａｒｄｅｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｌａｎｔ／Ｇｕａｎｇｘｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，

Ｎａｎｎｉｎｇ ５３００２３， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｙｏｕｎｇ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｓａｒｃａｎｄｒａ ｇｌａｂｒａ ａｎｄ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ＡＦＬＰ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ． Ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｒｏｃｅｓｓ of ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅ， ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ， ｄｉｌｕｔｉｎｇ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ， ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ＡＦＬＰ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓ． ｇｌａｂｒａ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ， ｄｏｓａｇｅ ｏｆ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ， ２０ ｎｇ／μＬ； ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， ４ ｈ； preamplification product diluted 15 times. ８ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ＡＦＬＰ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓ． ｇｌａｂｒａ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｓａｒｃａｎｄｒａ ｇｌａｂｒａ； ＡＦＬＰ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ； ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ

草珊瑚（Ｓａｒｃａｎｄｒａ ｇｌａｂｒａ）又名腫節(jié)風(fēng)、九節(jié)茶，是金粟蘭科（Ｃｈｌｏｒａｎｔｈａｃｅａｅ）草珊瑚屬植物，其全株具有祛風(fēng)通絡(luò)、活血散瘀、接骨續(xù)筋等功效，民間常用來治療跌打損傷、關(guān)節(jié)風(fēng)濕等疾病［１］。近年來對草珊瑚的研究發(fā)現(xiàn)其成分多樣，具有多種藥理作用，如抗菌、抗病毒、抗腫瘤等［２］，現(xiàn)已開發(fā)出多種產(chǎn)品（草珊瑚片、草珊瑚注射液、草珊瑚浸膏、草珊瑚含片等）。草珊瑚分布廣泛，各產(chǎn)地品種混雜，質(zhì)量參差不齊。因此有必要運(yùn)用分子遺傳標(biāo)記技術(shù)對草珊瑚野生資源進(jìn)行分類、質(zhì)量分析、良種選育研究。目前，盡管ＩＳＳＲ［３］、ＲＡＰＤ［４］反應(yīng)體系已經(jīng)在草珊瑚上成功建立，但存在反應(yīng)體系擴(kuò)增條帶少、易受到反應(yīng)條件變化及材料來源不同的影響等問題。

ＡＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）是一種十分有效的分子標(biāo)記技術(shù)［５］，其不需要預(yù)先知道基因組的序列特征，檢出的多態(tài)位點能覆蓋整個基因組，具有穩(wěn)定可靠、重復(fù)性強(qiáng)、靈敏度高等特點，而且操作程序易于標(biāo)準(zhǔn)化［６］，已被廣泛應(yīng)用于植物研究中［７－１０］。本研究擬建立一套適合草珊瑚的ＡＦＬＰ反應(yīng)體系，以期為草珊瑚種質(zhì)資源地理變異分析及良種選育工作提供參考。

１ 材料與方法

１．１ 材料與儀器

實驗材料為廣西不同產(chǎn)地采集的１８份野生草珊瑚種質(zhì)資源，取其鮮嫩葉片用硅膠干燥保存。

限制性內(nèi)切酶ＭｓｅⅠ和ＥｃｏＲⅠ購自ＭＢＩ公司，Ｔ４ ＤＮＡ連接酶、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰｓ購自天根生化科技（北京）有限公司，ＭｓｅⅠ／ＥｃｏＲⅠ連接接頭和引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，親和硅烷和剝離硅烷購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。電泳儀、ＰＣＲ儀、凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司，大型垂直電泳系統(tǒng)購自北京市六一儀器廠，離心機(jī)購自德國Ｓｉｇｍａ公司。

１．２ 實驗方法

１．２．１ 基因組ＤＮＡ的提取與檢測 采用改良的ＣＴＡＢ法提取草珊瑚葉片基因組ＤＮＡ［１１］，用０．８％的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取ＤＮＡ的純度和完整性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的λＤＮＡ濃度將提取的草珊瑚基因組ＤＮＡ統(tǒng)一稀釋為５０ ｎｇ／μＬ。

１．２．２ 草珊瑚ＡＦＬＰ體系的建立 ＡＦＬＰ實驗按照Ｖｏｓ等［５］的方法進(jìn)行，并對模板ＤＮＡ用量、酶切時間、預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋倍數(shù)等條件進(jìn)行優(yōu)化。①基因組ＤＮＡ的雙酶切。分別取１００、２００、３００、４００、５００ ｎｇ草珊瑚基因組ＤＮＡ，加入４ Ｕ ＭｓｅⅠ和１０ Ｕ ＥｃｏＲⅠ進(jìn)行雙酶切，總反應(yīng)體系為２０ μＬ，酶切時間分別為２、３、４、５ ｈ。②接頭連接。取酶切后的ＤＮＡ樣品，加入ＭｓｅⅠ／ＥｃｏＲⅠ接頭及１ Ｕ Ｔ４ ＤＮＡ連接酶于１６ ℃下連接３ ｈ。③預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)。取３ μＬ稀釋１０倍后的連接產(chǎn)物作為擴(kuò)增模板進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增。④選擇性擴(kuò)增。分別取稀釋５、１０、１５、２０倍的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物３ μＬ進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。⑤變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染。參考文獻(xiàn)［１２］的方法進(jìn)行。⑥選擇性引物篩選。每個ＥｃｏＲⅠ引物分別與每個ＭｓｅⅠ引物進(jìn)行組合，共有６４對引物組合，選出１０個具有代表性的草珊瑚ＤＮＡ樣品用于ＡＦＬＰ分析中選擇性擴(kuò)增引物的篩選。選出多態(tài)性較好、分布均勻、電泳譜帶清晰可辨的引物組合。

２ 結(jié)果與分析

２．１ 基因組ＤＮＡ的提取結(jié)果

從圖１可知，提取的草珊瑚的基因組ＤＮＡ長度約２３ ｋｂ，加樣孔比較干凈，無拖尾現(xiàn)象，說明所得到的ＤＮＡ完整性好、純度高，可用作后續(xù)實驗。

２．２ 基因組ＤＮＡ的雙酶切結(jié)果

基因組ＤＮＡ是否被完全酶切是影響ＡＦＬＰ結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素，模板用量的多少及酶切時間的長短都會對酶切結(jié)果產(chǎn)生較大的影響。酶切模板用量太少其產(chǎn)物的量不夠，太多則酶切不充分。不同物種的基因組大小不同，酶切時間長短也有差異。酶切時間不夠，酶切不完全，擴(kuò)增得到的結(jié)果不能真實地反映酶切位點的分布情況；酶切時間過長，會產(chǎn)生星號活性，降低ＰＣＲ擴(kuò)增的特異性。從實驗結(jié)果來看，２０ μＬ雙酶切反應(yīng)體系中ＤＮＡ模板用量在３００～５００ ｎｇ范圍內(nèi)都能得到理想結(jié)果，綜合考慮經(jīng)濟(jì)及結(jié)果準(zhǔn)確性的因素，確定草珊瑚ＡＦＬＰ反應(yīng)體系最佳的ＤＮＡ模板用量為４００ ｎｇ，即濃度為２０ ｎｇ／μＬ。圖２顯示了酶切時間分別為２、３、４、５ ｈ時的雙酶切產(chǎn)物，從圖中可以觀察到，雙酶切產(chǎn)物在電泳圖片上均呈彌散狀，且隨著時間的延長，其濃度越來越大，從實驗周期及雙酶切效果來看，選定酶切時間為４ ｈ較合適。

２．３ 預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋倍數(shù)的影響

預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)在整個ＡＦＬＰ分析過程中起著過渡作用，它在反映酶切和連接結(jié)果的同時，又直接影響下一步的選擇性擴(kuò)增。將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋后用作選擇性擴(kuò)增的模板，用６４對引物組合分別進(jìn)行擴(kuò)增，其產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖３。稀釋２０、１５、１０、５倍后的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物作模板，均能取得良好的擴(kuò)增效果，但從實驗結(jié)果的可靠性及實驗過程中節(jié)約材料兩方面綜合考慮，宜選擇稀釋１５倍。

２．４ 引物篩選結(jié)果

ＡＦＬＰ技術(shù)有多種引物組合，但并非任何引物組合都適合品種指紋分析，必須針對具體的植物進(jìn)行選擇。在大量的引物組合中快速有效地選擇出適合草珊瑚ＡＦＬＰ分析的引物組合，是該體系成功建立的關(guān)鍵，只要選擇的引物合適，利用１～２對引物就可以將大量的品種區(qū)分開。６４對引物組合對草珊瑚ＤＮＡ擴(kuò)增出的條帶數(shù)量、帶型質(zhì)量均不相同，根據(jù)多態(tài)性好、分布均勻、分辨率高的原則，篩選出了８對適合草珊瑚ＡＦＬＰ分析的引物組合（表１）。

２．５ 選擇性擴(kuò)增反應(yīng)

應(yīng)用上述建立的ＡＦＬＰ反應(yīng)體系，使用篩選到的８對引物組合對草珊瑚基因組ＤＮＡ進(jìn)行分析，擴(kuò)增出的條帶清晰、密度分布均勻、多態(tài)性強(qiáng)。圖４顯示了ＭｓｅⅠ－ＣＡＡ和ＥｃｏＲⅠ－ＡＧＣ引物組合進(jìn)行ＡＦＬＰ擴(kuò)增的結(jié)果。

３ 討論

目前分子標(biāo)記技術(shù)在藥用植物資源研究中得到了廣泛應(yīng)用，由于使用的標(biāo)記不同，其應(yīng)用價值也不一樣。如ＲＡＰＤ法存在結(jié)果不穩(wěn)定、重復(fù)性差、條帶少等缺點，不利于作標(biāo)準(zhǔn)ＤＮＡ指紋圖譜；ＲＦＬＰ和ＳＳＲ雖較穩(wěn)定，但需要相當(dāng)多的探針和ＳＳＲ引物，需要多次測定才能繪制較為有用的品種指紋；而ＡＦＬＰ技術(shù)具有穩(wěn)定、擴(kuò)增條帶多、信息量大的優(yōu)點，只要選擇的引物合適，就可以將大量的品種區(qū)分開，適合制作品種的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

不同的實驗材料在進(jìn)行ＡＦＬＰ分析時所需的條件也不一致，必須針對材料本身的特性對其反應(yīng)條件進(jìn)行適當(dāng)?shù)拿饕哉业阶罴逊磻?yīng)條件。ＡＦＬＰ技術(shù)對ＤＮＡ質(zhì)量要求很高，草珊瑚葉片中所含的多糖和酚類物質(zhì)氧化后會生成與ＤＮＡ結(jié)合的褐色物質(zhì)，不溶于水，影響后期實驗中酶的活性，因此在采樣時盡量選取草珊瑚的幼嫩葉片作為實驗材料。本研究中采用改良的ＣＴＡＢ法提取的草珊瑚基因組ＤＮＡ質(zhì)量好，符合實驗要求。基因組ＤＮＡ的酶切和連接是成功建立ＡＦＬＰ反應(yīng)體系的重要因素，對其時間的掌握非常重要，本研究中酶切４ ｈ后連接３ ｈ，既提高了工作效率又可以使酶切連接充分。在選擇性擴(kuò)增之前進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，既減少了非特異性擴(kuò)增，又減少了彌散的背景，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物要經(jīng)過適當(dāng)?shù)南♂尣拍苡米鬟x擇性擴(kuò)增的模板，本研究中選擇稀釋１５倍的產(chǎn)物作為模板，得到較理想的結(jié)果。

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