加拿大紅楓組織培養條件的優化

摘要：以加拿大紅楓（Ａｃｅｒ ｒｕｂｒｕｍ Ｌ．）的頂芽和側芽為外植體，考察不同消毒劑處理時間對消毒效果的影響，以及植物生長調節劑及其濃度配比對愈傷組織誘導及不定芽增殖的影響。結果表明，外植體的最佳采集時期為４月中旬；先用體積分數７０％的乙醇處理１５ ｓ，再用１ ｍｇ／ｍＬ ＨｇＣｌ２處理７ ｍｉｎ，最后用２０ ｍｇ／ｍＬ ＮａＣｌＯ浸泡２５ ｍｉｎ，加拿大紅楓外植體的消毒效果好，且存活率最高，為９０％。誘導加拿大紅楓愈傷組織的適宜培養基為１/２ ＭＳ＋２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＧＡ３。較適合加拿大紅楓不定芽增殖的培養基為１/２ ＭＳ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＧＡ３。

關鍵詞：加拿大紅楓（Ａｃｅｒ ｒｕｂｒｕｍ Ｌ．）；愈傷組織；不定芽；誘導

中圖分類號：Ｓ７２３．１＋３２；Ｓ７９２．３５ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）17－3872-04

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Cｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｃａｎａｄｉａｎ Ｍａｐｌｅ

ＨＵ Ｘｕｅ－ｙａｎ１，ＨＵ Ｙｅ－ｈｕａ１，ＧＵＡＮ Ｑｉａｎ２，ＬＩＡＮ Ｆａｎｇ－ｑｉｎｇ２，ＣＨＥＮ Ｙｉ－ｆａｎｇ１

（１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｊｉａｎｇｘｉ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎａｎｃｈａｎｇ ３３００１３，China；

２. College of Landscape and Art， Ｊｉａｎｇｘｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎａｎｃｈａｎｇ ３３００４６，China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｂｕｄｓ ａｎｄ ｌａｔｅｒａｌ ｂｕｄｓ ｏｆ Ｃａｎａｄｉａｎ ｍａｐｌｅ（Ａｃｅｒ ｒｕｂｒｕｍ Ｌ．） ａｓ ｅｘｐｌａｎｔｓ， ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔａｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｔｉｍｅ ｏｎ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｎ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ ｐｅｒｉｏｄ ｏｆ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｗａｓ ｉｎ ｍｉｄ－Ａｐｒｉｌ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｉｎ ７０％ ａｌｃｏｈｏｌ ｆｏｒ １５ ｓ， ｔｈｅｎ ｉｎ １ ｍｇ／ｍＬ ＨｇＣｌ２ ｆｏｒ ７ ｍｉｎ ａｎｄ ｉｎ ２０ ｍｇ／ｍＬ ＮａＣｌＯ ｆｏｒ ２５ ｍｉｎ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｃａｌｌｕｓ ｗａｓ １/２ ＭＳ＋２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＧＡ３． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｗａｓ １/２ ＭＳ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．１ｍｇ／Ｌ ＧＡ３．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｃａｎａｄｉａｎ ｍａｐｌｅ（Ａｃｅｒ ｒｕｂｒｕｍ Ｌ．）； ｃａｌｌｕｓ； ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｓｈｏｏｔｓ； ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ

加拿大紅楓（Ａｃｅｒ ｒｕｂｒｕｍ Ｌ．）別名紅花槭、北美紅楓、北方紅楓、美國紅楓、沼澤楓、紅糖槭、猩紅楓等，屬槭樹科槭樹屬，原產于北美洲，主要分布在加拿大和美國東北部的大部分地區。屬于大型喬木，樹形直立向上，樹冠圓形，整潔優美，葉、花、果均有很高的觀賞價值［１］。其生長速度快，適應范圍廣，在園林綠化中被廣泛應用［２］。加拿大紅楓在我國引種的時間不長，繁殖方式也以播種、嫁接為主，但繁殖系數較低，而引種栽培價格又比較貴，嚴重影響了紅楓的規模發展與推廣［３，４］。組織培養技術具有效率高、生長快、周期短、重復性強等優點［５］，關于加拿大紅楓的組織培養研究已有一定的報道。如王振龍等［６］曾以其種胚為材料誘導出愈傷組織并增殖；宗樹斌等［７］以實生苗葉片和嫩莖為外植體誘導出愈傷組織并增殖成功。本實驗以加拿大紅楓枝芽為外植體進行組織培養，摸索適宜的外植體消毒方式、采集時期，優化誘導愈傷組織及不定芽的培養基，以期為建立加拿大紅楓組培快繁技術體系奠定基礎。

１ 材料與方法

１．１ 材料與儀器

外植體取自江西科技師范大學楓林校區花圃２００９年１２月底引種的加拿大紅楓１～２年生優質苗木。于２０１０年３～１０月苗木生長季節，在晴朗的午后１４∶００～１５∶００采集生長優良無病蟲害的枝芽（頂芽和側芽）為外植體。

主要儀器包括ＰＹＸ－３００Ｑ－Ａ人工氣候培養箱（韶關市科力實驗儀器有限公司）、ＺＨＪＨ－１２１４Ｂ垂直流超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）、ＪＪ５００型精密電子天平（美國雙杰兄弟公司）、電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精密實驗設備有限公司）、立式高壓蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ超純水系統（美國ＭｉｌｌｉＰｏｒｅ公司）等。

１．２ 實驗方法

１．２．１ 外植體的預處理 選取加拿大紅楓枝芽為外植體，首先將取回的材料在１０％的洗衣粉水中浸泡３０ ｍｉｎ，用試管刷蘸洗衣粉水順著芽生長的方向輕輕刷洗后用自來水沖洗干凈，剪成１．５～２．０ ｃｍ帶芽的小段，再在流水下沖洗４０ ｍｉｎ左右。

１．２．２ 外植體的消毒 外植體預處理后置于超凈工作臺上，枝芽先后用７０％的乙醇（體積分數，下同）、１ ｍｇ／ｍＬ的ＨｇＣｌ２和２０ ｍｇ／ｍＬ的ＮａＣｌＯ浸泡處理，每次處理后用無菌水沖洗５～６次，處理過程中均需用鑷子攪動或晃動，以達到充分處理的目的，各處理不同消毒劑的具體處理時間見表１，將消毒處理后的外植體接種到１/２ＭＳ培養基上，在培養溫度（２５±２）℃、濕度６５％、光照時間１４ ｈ／ｄ、光照度１ ５００～２ ０００ ｌｘ［８］的條件下培養７ ｄ，統計各處理的污染率、死亡率、存活率。

污染率＝污染的外植體數／接種的外植體總數×１００％

死亡率＝褐化死亡的外植體數／接種的外植體總數×１００％

存活率＝１－污染率－死亡率

１．２．３ 外植體采樣時期對污染率的影響 分別于３月上旬、４、５、６、７和９月中旬采集莖段外植體，依次用７０％的乙醇處理１５ ｓ、１ ｍｇ／ｍＬ的ＨｇＣｌ２處理７ ｍｉｎ、２０ ｍｇ／ｍＬ的ＮａＣｌＯ浸泡處理２５ ｍｉｎ，每次處理后用無菌水沖洗５～６次，其他培養條件同１．２．２，觀察外植體采樣時期對其污染率的影響。

１．２．４ 愈傷組織的誘導 在無菌條件下切除外植體直接接觸消毒液的切口，保留芽部分。以１/２ＭＳ為基本培養基，將處理好的枝芽接種于添加了不同濃度生長調節劑的培養基上，各生長調節劑濃度組合見表３，每處理接種數為２０瓶，每瓶１個外植體，３０ ｄ后統計愈傷組織誘導率［９］。

誘導率＝出愈外植體個數／接種的外植體總數×１００％

１．２．５ 不定芽的增殖 在無菌條件下將形成的愈傷組織切割為０．５～０．８ ｃｍ２大小的小塊，轉接到新的培養基中，培養基配方與愈傷組織誘導培養基相同，每個培養基接種１塊愈傷組織。４０ ｄ后觀察統計不同生長調節劑及其配比對不定芽增殖的影響。

２ 結果與分析

２．１ 消毒劑處理時間對外植體污染率的影響

各消毒劑的處理時間不同，外植體的污染率和死亡率也不同（表１）。由表１可以看出，隨著消毒劑處理時間的延長，外植體的污染率總體呈下降趨勢，但處理時間過長，死亡的外植體個數也增加，表明過長時間的處理會對外植體造成損傷。７０％的乙醇、１ ｍｇ／ｍＬ的ＨｇＣｌ２、２０ ｍｇ／ｍＬ的ＮａＣｌＯ處理時間分別為１５ ｓ、７ ｍｉｎ、２５ ｍｉｎ，外植體的污染率為１０％，死亡率為０，存活率最高，為９０％，是較適宜的外植體消毒處理時間。

２．２ 不同采集時期對外植體污染的影響

不同時期采集的外植體消毒后用于組織培養，污染率、死亡率和存活率結果見表２。由表２可以看出，３月上旬接種的外植體污染率最低，只有１０．０％，但其死亡率高達４０．０％，這可能是因為采集外植體時間較早，外植體尚未萌動。４月中旬采集的外植體消毒效果最好，污染率和死亡率均較低，存活率高達６５．０％，此時植株開始進入生長旺盛期，且新生枝莖暴露的時間較短，帶菌較少，因而消毒效果最好。隨著植物生長期的延長，５～９月采集的外植體存活率逐漸降低。外植體在自然狀態下暴露的時間越長，帶菌量增多，導致污染率上升，同時植株開始木質化，樹芽逐漸進入休眠狀態，組織培養的存活率也因此降低。

２．３ 不同生長調節劑及其配比對愈傷組織誘導的影響

外植體接種９ ｄ后，個別枝芽切口部分變綠或側芽處產生愈傷組織，產生的愈傷組織會慢慢膨大，呈淺綠色或暗紅色的團狀結構（圖１）。由實驗結果（表３）可知，６－ＢＡ、２，４－Ｄ和ＮＡＡ均會對加拿大紅楓愈傷組織的誘導產生影響。在添加相同濃度的６－ＢＡ時，愈傷組織的誘導率隨著ＮＡＡ濃度的升高而降低，說明在實驗范圍內低濃度的ＮＡＡ有利于愈傷組織的誘導。而ＮＡＡ濃度為０．１ ｍｇ／Ｌ時，培養基中添加２．０ ｍｇ／Ｌ的６－ＢＡ，愈傷組織誘導率最高，其中４、１０、１１號處理中愈傷組織誘導率均為１００％。培養基中添加２，４－Ｄ較未添加時愈傷組織生長狀況好，添加量為０．５ ｍｇ／Ｌ時愈傷組織較疏松，生長快，顏色鮮艷。所以確定１/２ ＭＳ＋２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＧＡ３為愈傷組織誘導的最適培養基。

２．４ 不同生長調節劑及其配比對不定芽誘導的影響

將愈傷組織轉接到新的培養基中，４０ ｄ后，１號處理中有４個不定芽發生，３號處理中誘導出了２個不定芽（圖２），其他的培養基中不見不定芽發生，初步判斷適宜誘導不定芽的培養基為１/２ ＭＳ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＧＡ３。

３ 小結與討論

３．１ 外植體的消毒效果

在植物組織培養過程中，外植體消毒是最初的也是極為重要的步驟。一般來說，材料的消毒措施力度（消毒劑的殺菌力、使用濃度、消毒時間等）越強，滅菌就越徹底，污染率就越低，但是消毒劑對植物組織細胞具有一定的毒性，消毒力度過強會使細胞機能受損，從而降低成活率［１０－１２］。判斷某種消毒方法適合與否，要同時考察污染率和死亡率，以存活率為主要依據［１３］。

外植體的生理活性狀態和季節環境變化對其消毒效果亦有顯著的影響［１４］。春、夏季植物生長旺盛、生命力強，且光照充足不利于雜菌滋生，采集的外植體帶菌量低，消毒效果好；而秋季植物體生理代謝緩慢、枝條木質化程度高，采集的外植體通常帶菌量高，難以獲得理想的消毒效果。而且隨著加拿大紅楓生長期的延長，色素會不斷累積，從而導致接種的外植體容易發生褐變，因此秋季尤其不宜采集組培材料。本實驗研究結果表明，在采用相同的消毒方式處理時，４月中旬采集的外植體存活率最高；而最佳的消毒方法為首先經體積分數７０％的乙醇消毒１５ ｓ，然后用１ ｍｇ／ｍＬ ＨｇＣｌ２溶液處理７ ｍｉｎ，再用２０ ｍｇ／ｍＬ ＮａＣｌＯ溶液消毒２５ ｍｉｎ。

３．２ 生長調節劑及其濃度配比對愈傷組織誘導的作用

生長調節劑是影響植物組織培養的關鍵因素，改變生長調節劑的種類和濃度已成為提高愈傷組織誘導與分化效率的有效手段。目前已有許多關于利用生長調節劑提高愈傷組織誘導率的報道，但是在實驗中，生長調節劑的種類和濃度組合的效果差異較大，這主要是由于外植體本身所含有的激素水平存在差異，從而所需要的外源激素不同［１５］。通過實驗得到的最佳生長調節劑配比為２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＧＡ３，其能夠使愈傷組織誘導率達到１００％。

３．３ 生長調節劑及其濃度配比對不定芽增殖的作用

轉接到增殖培養基中的愈傷組織只有２個處理誘導出了不定芽，無法最終確定生長調節劑及其濃度配比對不定芽增殖的影響，適宜的增殖培養基配方還有待于進一步研究和優化。

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