副豬嗜血桿菌ＰＣＲ檢測方法的建立與初步應(yīng)用

摘要：針對副豬嗜血桿菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ，ＨＰＳ）１６ Ｓ ｒＲＮＡ序列設(shè)計(jì)１對特異性引物，能擴(kuò)增出８２１ ｂｐ的特異性ＤＮＡ片段，并據(jù)此建立了快速準(zhǔn)確鑒定副豬嗜血桿菌ＰＣＲ方法，臨床試驗(yàn)證明該方法具有很好的特異性和敏感性。１３份疑似病料檢測結(jié)果表明，ＰＣＲ檢測結(jié)果與傳統(tǒng)生化鑒定結(jié)果符合率為１００％。結(jié)果表明已成功建立了副豬嗜血桿菌ＰＣＲ檢測方法，并可應(yīng)用于臨床副豬嗜血桿菌的檢測。

關(guān)鍵詞：副豬嗜血桿菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ，ＨＰＳ）；ＰＣＲ；檢測

中圖分類號：Ｓ８５２．６１ 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）17－3794-03

Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ Aｓｓａｙ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ

ＬＩＵ Ｊｉａｎ－ｋｕｉ，ＹＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｙａｎ，ＷＥＩ Ｃｈｕｎ－ｈｕａ，ＬＩ Ｘｉａｏ－ｈｕａ，ＤＡＩ Ａｉ－ｌｉｎｇ，ＹＡＮＧ Ｌａｎ－ｘｉｕ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｌｏｎｇｙａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｏｆ Ｌｏｎｇｙａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／Fujian Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｉｓ／ Fujian Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｌｏｎｇｙａｎ ３６４０００， Ｆｕｊｉａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ， ａ ｐａｉｒs ｏｆ ｐｒｉｍｅｒs ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｏ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ（ＨＰＳ） １６ Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ａ ８２１ ｂｐ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）． Ｉｔ ｗａｓ ｃｏｎｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ｂｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ ｉｎ ｐｉｇｓ ａｆｔｅｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ｉｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ １００％ ａｃｃｏｒｄａｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｃｌａｓｓｉｃ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ １３ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ． Ｉｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｏｒ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ； ＰＣＲ； ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

副豬嗜血桿菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ，ＨＰＳ）病又稱格拉澤氏病（Ｇｌａｓｓｅｒ′ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）。ＨＰＳ是存在于豬的上呼吸道的一種常在菌，在特定條件下可以侵入機(jī)體，引起以呼吸道癥狀為主的全身性疾病，以纖維素性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征［１－３］。該菌多與其他病原如豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒等混合感染，嚴(yán)重危害仔豬和青年豬的健康［４］。近幾年來副豬嗜血桿菌病在豬場不斷發(fā)生，已趨于流行，發(fā)病率和死亡率均呈顯著上升趨勢［１］。

由于副豬嗜血桿菌對營養(yǎng)要求比較苛刻，一般從病料中分離率較低［５］，使病原學(xué)診斷方法受到一定的限制。常規(guī)的血清學(xué)診斷方法存在操作繁雜、費(fèi)時費(fèi)力、敏感性和特異性低等不足［６］，和常規(guī)的診斷方法相比ＰＣＲ具有檢測快速、特異性強(qiáng)、敏感性高的優(yōu)點(diǎn)。因此，建立ＨＰＳ ＰＣＲ快速準(zhǔn)確的診斷方法對ＨＰＳ的防治具有重要意義，并可為其流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)手段。

１ 材料與方法

１．１ 菌株

副豬嗜血桿菌血清４型菌株由福建省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離并保存。鏈球菌、巴氏桿菌和產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ＥＴＥＣ）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

１．２ 主要試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂（ＴＳＡ）培養(yǎng)基和胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（ＴＳＢ）購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（ＮＡＤ）購自成都貝斯特試劑有限公司；ｒＴａｑ ＤＮＡ聚合酶和ＤＬ ２０００ Ｍａｒｋｅｒ?yàn)閷毶锕こ蹋ù筮B）有限公司產(chǎn)品。

１．３ 引物設(shè)計(jì)與合成

按文獻(xiàn)［７］的方法設(shè)計(jì)引物。上游引物為：５′－ＧＴＧＡＴＧＡＧＧＡＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴ－３′，下游引物為：５′－ＧＧＣＴＴＣＧＴＣＡＣＣＣＴＣＴＧＴＡ－３′，目的片段為８２１ ｂｐ，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

１．４ ＨＰＳ的分離培養(yǎng)與生化鑒定

按文獻(xiàn)［５］的方法進(jìn)行。

１．５ ＰＣＲ模板處理

副豬嗜血桿菌血清４型菌株在ＴＳＡ培養(yǎng)基上培養(yǎng)，用接種環(huán)挑取可疑單一菌落溶于４０ μＬ無菌蒸餾水中，煮沸１０ ｍｉｎ，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１ ｍｉｎ，上清液４℃保存?zhèn)溆谩⒁伤聘必i嗜血桿菌病豬的肺臟、心包液、關(guān)節(jié)液等接種于ＴＳＢ液體培養(yǎng)基中，３７℃培養(yǎng)１８ ｈ后，取４０ μＬ菌液煮沸１０ ｍｉｎ，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１ ｍｉｎ，上清液４ ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

１．６ ＰＣＲ擴(kuò)增

采用２０ μＬ反應(yīng)體系： １０ ×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ，ｄＮＴＰ １．６ μＬ （２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ），上下游引物各０．８ μＬ，模板２ μＬ，ｒＴａｑ ＤＮＡ聚合酶０．２ μＬ（５ Ｕ／μＬ），加ｄｄＨ２Ｏ至２０ μＬ。循環(huán)參數(shù)：９４ ℃ ５ ｍｉｎ；９４ ℃ ４５ ｓ，５６ ℃ ４５ ｓ，７２ ℃ １ ｍｉｎ，３５個循環(huán)；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。反應(yīng)完畢后用 １％瓊脂糖凝膠電泳后檢查結(jié)果。

１．７ ＰＣＲ反應(yīng)條件的優(yōu)化

對ＰＣＲ反應(yīng)的退火溫度（５３．５、５４．１、５５．１、５６．６、５８．６、６０．３、６１．３和６２．０ ℃）、引物濃度（０．０５、０．１０、０．２０、０．４０、０．８０和１．２０ ｍｍｏｌ／Ｌ）及ｄＮＴＰ濃度（０．０１、０．０２、０．０４、０．０８和０．１６ ｍｍｏｌ／Ｌ）等條件進(jìn)行優(yōu)化，篩選ＰＣＲ擴(kuò)增的最佳反應(yīng)體系和程序。

１．８ ＰＣＲ敏感性試驗(yàn)

將副豬嗜血桿菌血清４型菌株純培養(yǎng)后，取菌液進(jìn)行細(xì)菌平板計(jì)數(shù)測得菌液濃度為６．８×１０６ ＣＦＵ／ｍＬ，將其作為模板進(jìn)行１０倍倍比稀釋（１０－１、１０－２、１０－３、１０－４、１０－５、１０－６），每個梯度取菌液１ ｍＬ作為模板，采用優(yōu)化后的ＰＣＲ擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增，檢測其敏感性。

１．９ ＰＣＲ特異性試驗(yàn)

分別以副豬嗜血桿菌、鏈球菌、巴氏桿菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ＥＴＥＣ）的細(xì)菌培養(yǎng)液和豬細(xì)小病毒（ＰＰＶ）、豬圓環(huán)病毒２型（ＰＣＶ２）、豬偽狂犬病病毒（ＰＲＶ）的ＤＮＡ為模板，進(jìn)行ＰＣＲ反應(yīng)，驗(yàn)證ＰＣＲ的特異性。

１．１０ 臨床樣品的檢測與序列比對

對閩西幾個規(guī)模化豬場采集的１３份疑似副豬嗜血桿菌病料進(jìn)行ＰＣＲ檢測和生化鑒定，隨機(jī)挑取陽性產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與ＧｅｎＢａｎｋ的ＨＰＳ １６ Ｓ ｒＲＮＡ進(jìn)行同源性比較分析。

２ 結(jié)果與分析

２．１ ＰＣＲ反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

對ＨＰＳ引物濃度、ｄＮＴＰ濃度、退火溫度等條件進(jìn)行了篩選。結(jié)果最佳退火溫度為５６．６ ℃（圖１），最佳ｄＮＴＰ濃度為０．０４ ｍｍｏｌ／Ｌ（圖２），最佳引物濃度為０．２０ ｍｍｏｌ／Ｌ（圖３）。

２．２ ＰＣＲ反應(yīng)程序的確定

通過對ＰＣＲ 擴(kuò)增條件優(yōu)化，最終確定反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：９４ ℃ ５ ｍｉｎ；９４ ℃ ４５ ｓ，５６．６ ℃ ４５ ｓ，７２ ℃ １ ｍｉｎ，３５個循環(huán)；７２ ℃ 延伸１０ ｍｉｎ，４ ℃保存。

２．３ 特異性試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示只有ＨＰＳ擴(kuò)增出特異性條帶，而其他對照組均未擴(kuò)增出明顯條帶（圖４）。

２．４ 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

將副豬嗜血桿菌菌液做１０倍倍比稀釋后，進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，結(jié)果顯示陽性結(jié)果的最高稀釋度為１０－４（圖５），表明該法的最低檢出限為６．８×１０２ ＣＦＵ／ｍＬ。

２．５ ＰＣＲ的臨床應(yīng)用和序列比對

對臨床１３份疑似病料進(jìn)行檢測，結(jié)果８份樣品為陽性（圖６），與生化鑒定結(jié)果一致，并隨機(jī)挑取４份ＰＣＲ陽性產(chǎn)物進(jìn)行了測序，與已發(fā)表的部分菌株同源性達(dá)到９９％～１００％。

３ 小結(jié)與討論

由于副豬嗜血桿菌對營養(yǎng)的要求特別苛刻，難于培養(yǎng)和分離，往往影響臨床的診斷結(jié)果。抗生素的大量使用也大大降低了副豬嗜血桿菌的分離率，給診斷和治療帶來一定困難。常規(guī)的血清學(xué)方法如瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)、ＥＬＩＳＡ［8，9］等靈敏性低，重復(fù)性差，往往導(dǎo)致診斷結(jié)果不準(zhǔn)確。而１６ Ｓ ｒＲＮＡ基因普遍存在于細(xì)菌并參與細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成過程，成為細(xì)菌分類和鑒定的一個重要標(biāo)志［10］。本試驗(yàn)根據(jù)副豬嗜血桿菌１６ Ｓ ｒＲＮＡ序列設(shè)計(jì)引物建立了快速的ＰＣＲ檢測方法。

本試驗(yàn)參考Ｏｌｉｖｅｉｒａ等［７］的方法設(shè)計(jì)引物，從而使目的片段得到有效擴(kuò)增，當(dāng)引物濃度增加至１．２０ ｍｍｏｌ／Ｌ或ｄＮＴＰ濃度增加為０．１６ ｍｍｏｌ／Ｌ時，均無法擴(kuò)增出目的條帶，說明在ＰＣＲ反應(yīng)中引物和ｄＮＴＰ濃度并不是越高越好。用建立的ＰＣＲ方法對副豬嗜血桿菌、鏈球菌、巴氏桿菌、ＰＰＶ、ＰＣＶ２、ＰＲＶ和產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ＥＴＥＣ）進(jìn)行了檢測，結(jié)果證明該方法對ＨＰＳ有較好的特異性，敏感性試驗(yàn)最低可檢測到６．８×１０２ ＣＦＵ／ｍＬ細(xì)菌量。

對臨床病料的檢測，ＰＣＲ檢測結(jié)果和傳統(tǒng)生化鑒定結(jié)果符合率為１００％，本試驗(yàn)可直接以菌液為模板進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，使ＰＣＲ診斷方法變得更為快速、簡便，遠(yuǎn)比傳統(tǒng)生化鑒定需要的時間短。

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