１株絮凝劑高產菌的篩選及其培養條件優化

摘要：從污水中篩選到１株新型高效微生物絮凝劑產生菌Ｎ－７， 根據其形態特征、生理生化特性初步鑒定為桿菌。該菌培養３２ ｈ進入穩定期，３６ ｈ時絮凝活性達到最大。通過單因素試驗和正交試驗表明，菌株Ｎ－７最適培養基為初始ｐＨ ７．５、培養溫度３０ ℃、轉速１７０ ｒ／ｍｉｎ，在此條件下，所產絮凝劑對高嶺土懸液的絮凝率高達 ９１．３％。

關鍵詞：菌株篩選；微生物絮凝劑；正交試驗；優化

中圖分類號：Ｘ７０３．５ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）17－3715-04

Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ a Ｈｉｇｈ Ｆｌｏｃｃｕｌａｎｔｓ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｂａｃｔｅｒｉａ Stain ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ

Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ

ＷＡＮＧ Ｓｈｕｏ１，ＺＨＡＯ Ｙｉ－ｌｉｎｇ２，ＨＵＡＮＧ Ｄｅ－ｚｈｉ１，ＺＨＡＮＧ Ｃａｎ１，ＸＵＥ Ｙｏｎｇ－ｃｈａｎｇ１

（１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｄａｌｉａｎ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｄａｌｉａｎ １１６０３４，Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ；

２．Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ｈｕａｙｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１００３４，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ｎｅｗ ｈｉｇｈ ｆｌｏｃｃｕｌａｎｔｓ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ strain Ｎ－７ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ． Ｉｔ ｗａｓ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ ａ ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｉｔｓ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ and ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ． Ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｒｅａｃｈｅｄ ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅ ａｆｔｅｒ been cultured for ３２ ｈ， ａｎｄ ｈａｄ the ｍａｘｉｍｕｍ flｏｃｃｕｌａｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｆｔｅｒ ３６ ｈ． According to ｓｉｎｇｌｅ－ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ， ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｆｌｏｃｃｕｌａｎｔｓ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ７．５， ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ３０ ℃， ｒｏｔａｔｉｏｎ ｓｐｅｅｄ １７０ ｒ／ｍｉｎ. Tｈｅ ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ Ｋａｏｌｉｎ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｒｅａｃｈｅｄ to ９１．３％ under the optimized conditions．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： strain ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ； ｂｉｏｆｌｏｃｃｕｌａｎｔ； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ； ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ

絮凝劑是一種可使液體中不易沉降的固體懸浮顆粒凝聚沉降的物質。傳統的絮凝劑按照其化學成分可分為無機絮凝劑和有機絮凝劑兩類。其中無機絮凝劑是指利用鐵、鋁等金屬離子沉降液體中不易沉降的固體懸浮顆粒，有機絮凝劑主要是指聚丙烯酰胺等一些具有高絮凝性的有機試劑［１－３］。傳統的絮凝劑由于成本低而被廣泛應用，但傳統的絮凝劑存在二次污染現象，對人類身體健康和自然環境有潛在危害。因此，開發高效、無毒、無二次污染的新型絮凝劑具有重要的意義［４］。

微生物絮凝劑是一類由微生物或其分泌物產生的代謝產物，其絮凝范圍廣、絮凝活性高，作用條件粗放，可以廣泛應用于污水和工農業廢水處理中。由于其具有高效、安全、不污染環境的優點，在醫藥、食品加工、生物產品分離等領域也有巨大的潛在應用價值［５－10］。由于微生物絮凝劑可以克服傳統絮凝劑的缺陷，最終實現無污染排放，因此微生物絮凝劑的研究正成為當今世界絮凝劑方面研究的重要課題。此前，國內外學者分離篩選出的產微生物絮凝劑的菌株有幾十種。國外對于微生物絮凝劑的應用部分已處于工業化，由于微生物絮凝劑成本較高、絮凝活性低，目前我國尚未廣泛應用于工業化生產中，本試驗從污水中篩選得到１株具有高效絮凝作用的菌株，通過對其絮凝條件的優化，以期為工業化應用奠定理論基礎。

１ 材料與方法

１．１ 材料

１．１．１ 菌株來源 試驗菌株分離自沈陽仙女河污水處理廠以及沈陽西部污水處理中心收集的污水樣品。

１．１．２ 培養基 牛肉膏蛋白胨培養基、高氏１號培養基、麥芽汁培養基、查氏培養基、ＰＤＡ培養基。

１．１．３ 菌株分離 將污水充分振蕩后，吸取１ ｍＬ懸濁液，加入到裝有５０ ｍＬ培養基的三角瓶中，１６０ ｒ／ｍｉｎ、 ２８ ℃的條件下振蕩培養２４ ｈ后取出，用去離子水將懸濁液稀釋成濃度梯度為１０－１～１０－５的懸濁液。分別吸取０．０８ ｍＬ 懸液涂在篩選培養基平板上。２８ ℃培養２～５ ｄ，用平板劃線的方法反復劃線，得到單一菌株。

１．１．４ 模擬污水的制備 以菌株對高嶺土懸濁液的絮凝效果作為菌株是否具有絮凝作用的判斷依據。用化學純高嶺土和去離子水制成的４ ｇ/Ｌ懸濁液作為模擬污水。

１．２ 方法

１．２．１ 菌株富集培養與初篩 在２５０ ｍＬ三角瓶中加入５０ ｍＬ液體培養基，挑取篩選培養基上的單一菌株接種于液體培養基中，１６０ ｒ／ｍｉｎ、２８ ℃振蕩培養２４ ｈ。采用高嶺土懸濁液測試培養液的絮凝活性。篩選出絮凝活性較高的菌株。

１．２．２ 菌株復篩 將初篩獲得的有較高絮凝活性的菌株用平板劃線法進行純化分離，２８ ℃恒溫培養１～２ ｄ，觀察菌落生長情況。待充分生長后選單個菌落接種于裝有５０ ｍＬ培養基的２５０ ｍＬ錐形瓶中擴大培養４８ ｈ，培養條件同初篩。試驗重復３次，篩選出絮凝率較為穩定的菌株作為本試驗后續研究的出發菌株。

１．２．３ 絮凝活性測定 以高嶺土懸浮液模擬實際廢水，取濃度為０．４％的高嶺土懸液１００ ｍＬ于２５０ ｍＬ三角瓶中，同時加入２ ｍＬ經培養２４ ｈ的菌液及５ ｍＬ ＣａＣｌ２溶液，以只加５ ｍＬ ＣａＣｌ２溶液、不加菌液的高嶺土懸液作為對照，三角瓶充分振蕩２ ｍｉｎ，靜置８ ｍｉｎ，用移液槍吸取上清液，測定其在５５０ ｎｍ處的吸光度。通過公式（１）計算出絮凝率［１１－１４］。

η=■×１００％ （１）

式中：A為對照上清液５５０ ｎｍ處的吸光度；Ｂ為樣品上清液５５０ ｎｍ處的吸光度。

１．２．４ 絮凝條件的優化研究 培養條件的優化：以篩選培養基的培養條件為基礎，通過分別改變培養基的初始ｐＨ、培養溫度、搖床轉數和培養時間等條件測定發酵液對高嶺土懸液的絮凝率，確定該菌種的最佳培養條件。試驗初始ｐＨ分別設為６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０，進行了３次平行試驗；對培養溫度分別設為２４、２６、２８、３０、３２、３４ ℃，進行了３次平行試驗；對搖床轉速分別為１４０、１５０、１６０、１７０、１８０ ｒ／ｍｉｎ進行了３次平行試驗。

２ 結果與分析

２．１ 絮凝劑產生菌的篩選結果

試驗從牛肉膏蛋白胨培養基上分離得到１３株菌，編號分別為Ｎ－１，Ｎ－２，……，Ｎ－１３；從高氏１號培養基上分離得到７株菌，編號分別為Ｇ－１，Ｇ－２，……，Ｇ－７；從麥芽汁培養基上分離得到４株菌，編號分別為Ｍ－１，Ｍ－２，Ｍ－３，Ｍ－４；從查氏培養基上分離得到２１株菌，編號分別為Ｃ－１，Ｃ－２，……，Ｃ－２１，從ＰＤＡ培養基上分離得到２株菌，編號分別為Ｐ－１，Ｐ－２。上述菌株經初篩后得到１８株具有絮凝作用的菌株。經過復篩后得到６株絮凝率超過５０％的菌株，分別為Ｎ－６，Ｎ－７，Ｎ－１３，Ｃ－４，Ｃ－１５，Ｃ－１９。以上６株菌通過反復接種傳代３次后，菌株Ｎ－７的絮凝效果最穩定，因此本研究選取Ｎ－７作為后續試驗菌株。

２．２ N-7菌落形態

菌株Ｎ－７在牛肉膏蛋白胨培養基上形成橘黃色半透明菌落（圖１），表面光滑、黏稠，單菌落直徑０．４～０．６ ｍｍ。生理生化試驗表明，革蘭氏染色陰性，無芽孢，接觸酶試驗陽性，甲基紅試驗陰性，Ｖ－Ｐ試驗陰性，發酵產酸不產氣，輕微水解淀粉，明膠液化試驗陰性。

２．３ 單因素試驗結果

２．３．１ 培養時間 將１ ｍＬ菌種液接于ｐＨ ７．０的發酵培養基中，于３０ ℃、１６０ ｒ／ｍｉｎ搖床中培養，試驗從第３０小時起，每２ ｈ取樣進行絮凝率測定，共取７個時間點，結果如圖２所示。由圖２可知，絮凝率隨著培養時間的增加呈先升高再緩慢下降的趨勢，在３６ ｈ處達到最高點８９．０％，隨后出現緩慢下降趨勢，結合菌體生長曲線可知，菌體在３２ ｈ后開始進入穩定期，３６ ｈ時菌體數量和活性基本穩定，表明菌體此時產生微生物絮凝劑的效果最佳，隨著培養時間的增加，菌體出現老化現象，菌體活性隨之下降，菌體的絮凝效果也逐漸降低，因此本試驗確定培養時間為３６ ｈ。

２．３．２ 培養基初始ｐＨ 制備Ｎ－７菌株種子液，取１ ｍＬ種子液分別接種于初始ｐＨ為６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０的發酵培養基，３０ ℃、１６０ ｒ／ｍｉｎ搖床培養３６ ｈ，取發酵培養基的菌懸液２ ｍＬ加入到高嶺土懸濁液中，充分振蕩后靜置８ ｍｉｎ，在５５０ ｎｍ的條件下測吸光值，進行３次平行試驗，結果如圖３所示。由圖３可知，培養基初始ｐＨ對菌體的絮凝效果有直接的影響，絮凝率呈先逐漸增加后緩慢下降的趨勢，在ｐＨ為７．５時最大，達到８１．２％。因此菌體絮凝率達到最高的培養基的初始ｐＨ為７．５。

２．３．３ 培養溫度 取１ ｍＬ Ｎ－７菌株的種子液分別接種于６瓶初始ｐＨ ７．５的發酵培養基中，溫度分別設置為２４、２６、２８、３０、３２、３４ ℃，在轉速為１６０ ｒ／ｍｉｎ的搖床培養３６ ｈ，取發酵培養基的菌懸液２ ｍＬ加入到高嶺土懸濁液中，充分振蕩后靜置８ ｍｉｎ，在５５０ ｎｍ的條件下測吸光值，進行３次平行試驗，結果如圖４所示。由圖４可知，培養溫度對菌體的絮凝性也有較大的影響，絮凝率在２４～２８℃之間逐漸升高，從６９．５％升高到８７．３％；隨后開始下降，因此最佳培養溫度定為２８ ℃。

２．３．４ 培養轉速 取１ ｍＬ Ｎ－７菌株的種子液分別接種于５瓶初始ｐＨ ７．５的發酵培養基中，置于２８ ℃、轉速分別設置為１４０、１５０、１６０、１７０、１８０ ｒ／ｍｉｎ，振蕩培養３６ ｈ。取發酵培養基的菌懸液２ ｍＬ加入到高嶺土懸濁液中，充分振蕩后靜置８ ｍｉｎ，在５５０ ｎｍ的條件下測吸光值，進行３次平行試驗，結果如圖５所示。由圖５可知，轉速的高低直接影響到菌體的生長繁殖以及代謝物的分泌，因此對絮凝率的影響也很關鍵，隨著培養轉速的不斷增加，絮凝率呈現先升高后降低的趨勢，在轉速為１６０ ｒ／ｍｉｎ時達到最高點（８７．２％），所以最佳培養轉速定為１６０ ｒ／ｍｉｎ。

２．４ 正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，以菌體絮凝性的大小為考察指標，采用Ｌ９（４３）正交表，進行４因素３水平的正交試驗。正交試驗設計與結果見表１。由表１可知，４個因素對絮凝率影響大小依次為Ｃ、Ｄ、Ｂ、Ａ，即培養溫度的影響最大；結合k值可知，優化提取工藝是Ｃ３Ｄ３Ｂ２Ａ２，即培養時間為３６ ｈ、初始ｐＨ為７．５、培養溫度為３０ ℃、培養轉速為１７０ ｒ／ｍｉｎ。按Ｃ３Ｄ３Ｂ２Ａ２進行３次平行試驗，測得平均絮凝率為９１．３％，高于正交試驗結果的最大值，因此認為正交試驗得出的最優水平是可靠的。

３ 結論

從污水中篩選得到的新型高效微生物絮凝劑產生菌株Ｎ－７，經過正交試驗優化得出其培養基在初始ｐＨ為７．５、培養溫度３０ ℃、搖床轉速１７０ ｒ／ｍｉｎ、培養３６ ｈ時所產絮凝劑對高嶺土懸液的絮凝率高達９１．３％。本試驗菌株來自污水中，培養基成本低、易篩選，并且通過對絮凝條件的優化，絮凝效果較好，可以對工農業生產中的污水處理及環境保護起到一定的積極作用。

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