ＳＳＲ鑒定水稻兩系雜交種純度的運用與探討Ⅱ．不同苗齡取樣方法對室內純度結果的影響

摘要：以水稻（Ｏｒｙｚａ ｓaｔｉｖａ Ｌ．）兩優１７為試驗材料進行標準發芽后，對幼苗進行大苗、小苗分類，并利用ＳＳＲ引物分別對其進行室內純度鑒定。鑒定結果表明，苗的大小對鑒定結果的影響較大，小苗與大苗的純度相差２．８個百分點，超出了允許的誤差范圍。與大田相比，大苗的純度更接近于田間秧苗純度。在田間小苗往往不能成苗，不影響大田純度，故小苗是造成室內與大田純度鑒定結果產生差異的重要原因之一。

關鍵詞：水稻（Ｏｒｙｚａ ｓaｔｉｖａ Ｌ．）；ＳＳＲ；室內；田間；純度鑒定

中圖分類號：Ｑ７８９；Ｓ５１１ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）17－3687-02

Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｅｄ Ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ Ｔｗｏ－ｌｉｎｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｒｉｃｅ ｂｙ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔ （ＳＳＲ）Ⅱ．Effects of Sampling Methods on Laboratory Purity Detection

ＬＩＡＯ Ｆａｎｇ-ｌｉ1，ＺＨＡＮＧ Ｙｕ-ｆｅｉ1，ＬＩＮ Meｉ1，ＺＨＡＯ Ｈｏｎｇ1，ＸＩＯＮＧ Ｘｉａｎ-ｆｅｎｇ1，ＴＵ Ｓｈｕ-ｘｉｎ2，ＺＨＡＮＧ Ｋａｉ3

（１．Ｓｅｅｄ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｂｕｒｅａｕ ｏｆ Ｊｉｎｇｚｈｏｕ， Ｊｉｎｇｚｈｏｕ ４３４０２０，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ； 2．Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０，Ｃｈｉｎａ；

3． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ， Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎｇｚｈｏｕ ４３４０２５，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｏｆ Ｌｉａｎｇｙｏｕ１７ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｓｔａｎｄａｒｄ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ ａｓ ｌａｒｇｅ or ｓｍａｌｌ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ． Ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｅｅｄ ｐｕｒｉｔｙ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ＳＳＲ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｉｚｅ ｏｆ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｈａｄ ｏｂｖｉｏｕｓ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｒｉｔｙ ａｓ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｌａｒｇｅ ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｗａｓ 2．8％， ｗｈｉｃｈ ｅｘｃｅｅｄ ｔｈｅ ａｌｌｏｗａｂｌｅ ｅｒｒｏｒ ｒａｎｇｅ． Ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｗａｓ ｓｉｍｉｌａｒ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ ｆｉｅｌｄ． Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ， ｔｈｅ ｓｍａｌｌ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｈａｄ ｌｉｍｉｔｅｄ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｆｉｅｌｄ ａｓ ｔｈｅｙ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｍａｔｕｒｅ ｔｈｕｓ ｗａｓ ｔｈｅ ｋｅｙ ｆａｃｔｏｒ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｅｅｄｓ ｐｕｒｉｔｙ ｉｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ ｆｉｅｌｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ ｓaｔｉｖａ Ｌ．）； ＳＳＲ； ｉｎｄｏｏｒ， ｆｉｅｌｄ； ｐｕｒｉｔｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

水稻（Ｏｒｙｚａ ｓaｔｉｖａ Ｌ．）的種子發芽率和成秧率是兩個概念，前者表示在規定條件和時間內長成的正常幼苗占供檢種子數的百分率，后者表示百個芽苗大田形成正常植株的株數。前人用ＳＳＲ標記檢測種子純度時，用于提取ＤＮＡ的材料大多來自兩個途徑［１-１０］，一是在田間植株上直接剪取葉片，二是在發芽箱內培養幼苗。第一種方法由于省去了種子樣品發芽、成秧等環節，其結果與原樣品實際純度有所差異；第二種方法由于發芽箱條件往往設定為種子的最適發芽環境，很多在田間不能成苗的種子在室內可以長成弱苗或殘苗，在取樣時，根據操作規程，這類小苗都被當成鑒定對象進行了檢測。這一批在大田有可能不能成秧的幼苗是否會影響到室內鑒定結果與大田生產中實際純度的吻合性，目前尚未見報道。本試驗模擬田間成秧率取樣，探索ＤＮＡ模板制備前，按室內標準發芽方法獲得的大苗、小苗對種子純度鑒定結果的影響，從而尋求減少或修正利用ＳＳＲ引物鑒定室內與田間純度之間誤差的途徑。

１ 材料與方法

１．１ 材料

所用雜交水稻品種兩優１７及其親本均由湖北省種子管理局統一提供。

所用引物及試劑均由北京鼎國生物有限公司提供。

１．２ ＰＣＲ反應體系

ＰＣＲ擴增反應總體積１０ μＬ ：１０×ｂｕｆｆｅｒ １ μＬ，１０ ｍmol/L ｄＮＴＰ ０．２ μＬ，５０ ｎｇ／μＬ ｐｒｉｍｅｒ ０．２ μＬ＋０．２ μＬ，２ U／μＬ Ｔａｑ酶 ０．６ μＬ，２５ ｎｇ／μＬ ＤＮＡ １ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ ６．８ μＬ。ＰＣＲ擴增程序：９４℃預變性４ ｍｉｎ； ９４ ℃變性１５ ｓ，５５ ℃退火１５ ｓ，７２ ℃延伸３０ ｓ，３５個循環；７２ ℃下延伸７ ｍｉｎ。擴增產物在濃度為３％、含ＥＢ的瓊脂糖凝膠中進行電泳后應用凝膠成像系統觀察記錄。

１．３ ＤＮＡ模板制備和引物篩選

ＤＮＡ模板的制備采用農業部推薦的簡易提取ＤＮＡ法。采用１０個單株幼苗抽提的ＤＮＡ混合物做模板，以消除雜株可能對篩選結果的干擾，然后用農業部推薦的４４對兩系雜交種常用ＳＳＲ引物分別對兩優１７及其父母本ＤＮＡ進行擴增，擴增產物在含EB的３％的瓊脂糖凝膠電泳后成像觀察。從中篩選出多態性高、共顯性強、譜帶清晰、雜株檢出率高的引物ＲＭ２１鑒定兩優１７。

１．４ 室內大苗和小苗的分類及純度鑒定

從兩優１７中隨機抽取９００粒種子，按ＧＢ／Ｔ ３５４３．４—１９９５進行發芽試驗。發芽兩周后按苗高分成兩類：小苗≤３ ｃｍ，大苗＞３ ｃｍ。將這兩類苗分別用ＲＭ２１引物進行純度鑒定。

１．５ 樣品的田間純度鑒定

從ＳＳＲ法室內檢測的同一份樣品中隨機抽出部分種子進行田間正季純度鑒定。種植成５００株的小區，共５０行，每行１０株，株距１７ ｃｍ，行距２７ ｃｍ。在小區前端種植該樣品的不育系和恢復系親本各兩行（２０株），作為田間雜株比對標樣。鑒定方法根據農作物種子檢驗規程真實性和品種純度鑒定標準（ＧＢ／Ｔ ３５４３．５—１９９５）執行。

２ 結果與分析

２．１ 室內樣品純度鑒定結果

從兩優１７中隨機抽取的９００粒種子中有７４５粒發芽，發芽率為８２．８％，將這兩類苗用SSR引物ＲＭ２１進行純度鑒定。室內檢測結果表明（表１），７４５個芽苗中，小苗１９１株，占總苗數２５．６％，其中檢出雜株３１株，小苗雜株率１６．２％，純度８３．８％；大苗５５４株，占總苗數７４．４％，其中檢出雜株７４株，大苗雜株率１３．４％，純度８６．６％。

２．２ 田間正季鑒定結果

田間鑒定與室內發芽所用的種子為同一份樣品。５００株中有雜株４８株，其中不育系９株，恢復系３株，其他異形株３６株，雜株率９．６％，純度９０．４％（表1）。

２．３ 室內與田間樣品純度鑒定結果比較

樣品田間正季純度鑒定結果比室內樣品的總體純度高４．５個百分點，比大苗的純度高出３．８個百分點，比小苗的純度高出６．６個百分點。室內ＳＳＲ鑒定中去掉小苗后，樣品的總體純度提高０．７個百分點，純度值上升０．８％。大苗純度鑒定結果與田間鑒定結果吻合度最高。

３ 小結與討論

結果表明，室內檢測取樣的幼苗大小對純度鑒定結果有明顯的影響。而在大田條件下，種子存在成秧率的問題，室內的弱苗、殘苗在大田中不能正常成秧，因此對大田純度不構成影響。按目前通用的單個引物檢測種子純度的操作規程，是將樣品中無論大苗、小苗均全部取樣進行檢測，并用這個純度結果去代表大田生產的質量狀況。這個結果是種子的分子生物學純度，實際上是一個微觀理論值，而種子質量標準規定判斷種子質量優劣的依據則是大田生產表現的植物形態學純度，是一個宏觀現實的數值。實際操作中將這類不能成秧的弱苗也納入檢測，使得室內檢測結果與大田種植結果之間存在一定的偏差。由于不同樣品中混雜的雜株類型不同，生活力也會不同，這種偏差對ＳＳＲ引物檢出純度的影響不同。因此，在室內鑒定時，如何取樣才能消除取樣誤差，使室內純度鑒定結果更能反映大田生產的真實純度，建議在進一步研究的基礎上，將明顯不能成秧的小苗或弱苗剔出檢測群體。

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