油茶餅粕多糖對體外α葡萄糖苷酶的抑制作用

摘 要：采用體外方法對從油茶餅粕中分離純化后的油茶餅粕多糖的α葡萄糖苷酶的抑制活性進行了測試.結果表明：油茶餅粕多糖由阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、甘露糖等構成，其相對分子質量為3 000～12 000；油茶餅粕粗多糖及各分級多糖的濃度與α葡萄糖苷酶的抑制活性呈現(xiàn)正相關，其IC50為0.053 mg/mL，油茶餅粕多糖具有抑制葡萄糖吸收的作用.

關鍵詞：油茶餅粕多糖；α葡萄糖苷酶；活性抑制；體外

中圖分類號：S789.9 文獻標識碼：AαGlucosidase Inhibitory Activity of Camellia

Cake Polysaccharides in Vitro

糖尿病的發(fā)生主要是因為血糖的來源與利用之間的動態(tài)平衡被破壞.多糖通過調節(jié)生物體內糖代謝酶來調節(jié)血糖水平，并通過抗氧化作用對血糖進行調節(jié) [1-2].糖尿病是以持續(xù)高血糖為基本生化特征的一種綜合病癥.主要是由于體內胰島素相對或絕對不足所引起的糖代謝紊亂所致.糖尿病患者長期處于高血糖狀態(tài)會引起失明、肢體壞死等并發(fā)癥[3].有研究表明茶多糖有較強的降血糖功能[4-5].而對油茶餅粕多糖在此方面的研究少有報道.

油茶餅粕多糖，是指山茶科山茶屬油茶（Camellia oleifera Abel.）經(jīng)過壓榨制油后的種籽中所含的雜多糖類成分.油茶是我國特有的木本油料，據(jù)《全國油茶產業(yè)發(fā)展規(guī)劃（2009-2020）》統(tǒng)計，我國現(xiàn)有油茶林面積302×104 hm2，年產油茶餅粕68.39萬噸.油茶籽在榨油后形成的餅粕，通常用于提取茶皂素.而據(jù)報道，榨油后的油茶籽餅粕中化學成分組成是：脂肪8.73%，水分1.52%，粗蛋白5.85%，皂素30.34%，總糖50.52%，灰分2.95%[6].因此對糖類化學成分的研發(fā)對于延長油茶產業(yè)鏈、增加副產物的附加值具有重要意義.

湖南大學學報（自然科學版）2012年第11期李湘洲等：油茶餅粕多糖對體外α葡萄糖苷酶的抑制作用 由于天然α葡萄糖苷酶抑制劑在糖尿病飲食療法中具有重要作用，因此研究天然α葡萄糖苷酶抑制劑的來源及應用十分必要[7].α葡萄糖苷酶抑制劑高通量篩選模型常用于降血糖藥物的體外篩選 [8].α葡萄糖苷酶是一種存在于小腸黏膜細胞刷狀緣的糖苷代謝酶，該酶針對雙糖發(fā)揮水解作用，使進入小腸的碳水化合物最終形成單糖，被機體吸收.因此，通過觀測α葡萄糖苷酶活性的變化情況，可獲得藥物抑制血糖的效果.與動物模型實驗比較，這是一種操作性強且高效的實驗方法.

本文研究油茶餅粕多糖對體外α葡萄糖苷酶抑制作用.首先測定了各分級多糖的相對分子質量.采取PMP柱前衍生高效液相色譜法分析多糖中的單糖組成.然后通過測定底物（蔗糖）在α葡萄糖苷酶作用下生成葡萄糖量，計算樣品對α葡萄糖苷酶的抑制率.

1 實驗部分

1.1 實驗材料

油茶餅粕：品種為普通油茶（Camellia oleifera），采集于湖南省株洲縣，采集時間為2009年10月.經(jīng)機械壓榨后的干燥餅狀物即為油茶餅粕.

12 試劑與儀器

葡萄糖試劑盒：中生北控生物科技股份有限公司，批號為112571；蔗糖：天津科密歐化學試劑有限公司，批號為1003042，用去離子水配制成30 mmol/mL作為底物溶液；阿卡波糖（Acarbose）：中國藥品生物制品檢定所，批號為1008082009202；PBS緩沖鹽：天津津脈公司生產，出廠代碼為JMF0006 ；生理鹽水：湖南科倫制藥有限公司生產，批號為091103503； DEAE52纖維素：北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司；其他試劑為分析純.

酶標儀：Thermo公司，型號Multiskan Ascent，96孔板；大鼠，SD雄性，體重230～270 g.

1.3 試驗方法

1.3.1 油茶餅粕多糖的制備及相對分子質量測定

油茶餅粕多糖：油茶餅粕經(jīng)脫脂、水提取、脫蛋白、乙醇沉淀后凍干獲得油茶餅粕粗多糖（CCP）.粗多糖上DEAE52纖維素層析柱，先后采用去離子水，0.1 mol/mL， 0.2 mol/mL，0.5 mol/mL氯化鈉溶液及0.5 mol/mL氫氧化鈉溶液洗脫，分別收集洗脫液后減壓濃縮，透析后冷凍干燥，獲得分級多糖.以已知系列相對分子質量葡聚糖為對照品，采用高效凝膠色譜法（HPGPC）測定各分級多糖的相對分子質量.采取PMP柱前衍生高效液相色譜法分析多糖中的單糖組成[9].

1.3.2 α葡萄糖苷酶抑制活性測定

α葡萄糖苷酶從大鼠腸黏膜內提取，于-20 ℃保存?zhèn)溆?實驗分為空白組、不加抑制劑的陰性組、 阿卡波糖陽性對照組和待測樣品組.酶液、阿卡波糖、油茶餅粕多糖樣品分別用PBS緩沖液溶解稀釋.在酶標儀96孔板中，依次加入如表1所示的各種試劑，經(jīng)過酶液與反應底物劑量預試后，最終反應體積50 μL，置于37 ℃恒溫箱保溫20 min.

按葡萄糖試劑盒使用的要求，在50 μL測量液中再加入1 500 μL酚試劑（試劑盒自帶），混合均勻，于37 ℃保溫20 min，以空白管調零，在492 nm處測吸光值，吸光值與葡萄糖生成量呈線性相關. 根據(jù)測定結果計算IC50（即抑制酶活性達到50%時所需要抑制劑的濃度）.

抑制百分率IR=（A測試-A樣品-A空白）/ （A測試-A空白） ×100 %.

表1 各實驗組的溶液配制

Tab.1 Reagents in each experimental group μL

測試組空白組樣品組陽性對照組緩沖液 12.525.000酶液25.025.025.025.0蔗糖溶液12.5012.512.5樣品溶液0012.50阿卡波糖溶液00012.52 結果與討論

2.1 多糖純化與相對分子質量測試的結果

經(jīng)過DEAE52纖維素柱層析對粗多糖樣品的分離， 不同溶劑洗脫后獲得的5個分級多糖.分別命名為CCP1， CCP2， CCP3， CCP4和CCP5.采用高效凝膠色譜法，以系列已知相對分子質量的葡聚糖為標準品，測定油茶餅粕多糖相對分子質量，結果見表2.