雌二醇強化壬基酚雄性毒性機理研究

摘 要：為了揭示壬基酚進入生物體內后對雄性的毒性作用機制，以典型天然激素雌二醇（E2）為代表，以大鼠睪丸支持細胞為對象，研究了壬基酚與E2共存時對雄性生殖細胞的毒性并考察了其作用機理.研究結果表明，壬基酚與E2均能促進睪丸支持細胞增殖，表現出較強的雄性毒性，混合后呈現明顯的強化效應，比二者單獨作用高.對細胞中特征蛋白波形蛋白的檢測發現，E2不影響波形蛋白的表達，壬基酚可提高其表達，而混合物可明顯提高其表達.機理分析表明，在絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的3條通路中，ERK通路是E2強化壬基酚毒性的關鍵通路.壬基酚降低ERK蛋白的表達，E2輕微降低ERK蛋白的表達，混合后反而誘導ERK蛋白的表達.壬基酚能夠顯著誘導pJNK蛋白、p38蛋白的表達，但與E2混合后，誘導作用減弱.轉錄因子分析表明，由于ERK通路被激活，壬基酚和E2混合物可極大地強化轉錄因子cMyc蛋白和cyclinD1蛋白的表達.

關鍵詞：雌二醇（E2）；壬基酚；睪丸支持細胞；波形蛋白；ERK通路；毒性

中圖分類號：X703.1 文獻標識碼：AMechanisms of Enhancing Male Toxicity

of Nonylphenol by 17Estradiol

環境激素是一類特殊污染物質，它們進入生物體后，激活或抑制內分泌系統的功能，能引起生殖系統損傷和神經損傷、誘發多種癌癥、破壞免疫系統[1].近年來，大量文獻報道人類的生育能力尤其是男性生育能力下降明顯，男性不育和生殖系統發育異常明顯增加[2].研究表明，這些現象的發生均可能與各種環境激素的存在有關[1].我國環境污染較為嚴重，多地均檢出多種環境激素[3]，而男性不育癥在我國也持續增長.其中壬基酚（Nonylphenol，NP）是廣泛檢出的一種環境激素[4]，其內分泌干擾毒性已被大量的野外觀察和實驗研究證實，能夠對雄性動物產生一系列生殖毒性[5-6]，但具體機制仍然不是很清楚.

湖南大學學報（自然科學版）2012年第11期張盼月等：雌二醇強化壬基酚雄性毒性機理研究生物體內含有天然激素，環境中的壬基酚進入生物體后，與天然激素共同發揮作用，可能存在拮抗、協同和疊加等效應.因此，將壬基酚與天然激素混合，研究其復合效應，對了解壬基酚的雄性毒性具有重要意義，而相關的報導基本是空白.本文選擇雌二醇（E2）作為天然激素的代表，E2是典型的雌激素，是人類雌激素中生物活性最強的一種；選擇大鼠作為生物體的代表，大鼠是毒理研究中常用的生物.將壬基酚與E2混合，考察其雄性毒性，并對其作用機制進行探討.

1 材料與方法

壬基酚、E2、胰蛋白酶、苯甲基磺酰氟、抑肽酶 A、亮抑肽酶、色胺酸等購自美國Sigma公司.丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺購自美國Ameresco公司.DMEM培養基、胎牛血清購于杭州四季青生物公司.E2單獨投加時濃度為1.0×10-12 mol/L，壬基酚單獨投加時濃度為1.0×10-8 mol/L，混合投加時各取50%.

實驗所用大鼠為2～7 d的雄性乳鼠（SCXK（黑） 20020001），取其睪丸支持細胞進行研究[7].睪丸支持細胞是雄性生殖系統的重要組成部分，直接控制精子的產生，也是雄性生殖毒性的經典研究對象[8].

主要設備包括：GeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems公司），DYY6B電泳儀（北京市六一儀器廠），蛋白質電泳及Western雜交轉膜系統（BioRad），LSM Meta510 激光共聚焦儀（Zeiss公司）、IGO 150二氧化碳培養箱（Thermo公司）.

睪丸支持細胞的增殖效應（PE）為實驗組與對照組吸光度平均值的比值采用Western Blot法測定絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號轉導通路相關蛋白，以βTublin蛋白作為內參照，對目的蛋白表達量進行校正[7，9].采用RTPCR法測定EDCs干擾效應相關的轉錄因子Cfos基因、Cjun基因[7，10].

每次試驗設定3次平行試驗，每次平行試驗設定6個平行樣，實驗數據最終經SPSS13.0方差分析進行處理.除非特殊說明，p<0.05.

2 結果與討論

21 對睪丸支持細胞增殖的影響

壬基酚、E2、混合物對于睪丸支持細胞增殖的影響如圖1所示.壬基酚和E2均能使睪丸支持細胞增殖，表明二者均具有一定的雄性毒性.壬基酚和E2混合后細胞增殖效應更加明顯，出現了加和效應.表明壬基酚進入生物體后，在天然雌激素的協同作用下，其雄性毒性加強，對生物體健康與遺傳安全性不利.