MTA1在胃癌細胞系和胃癌組織中的表達定位以及臨床意義

姚遠，李艷，趙鴻梅

(遼寧省人民醫院消化內一科，遼寧沈陽 110016)

胃癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，在國內不少地區的惡性腫瘤死亡統計中占首位或第2位［1］。腫瘤轉移相關基因(MTA)是最新發現的與癌癥進展相關的一個家族，MTA家族的成員包括3種不同的基因(MTA1、MTA2和 MTA3)和已經報道的6種亞型(MTA1、MTA1s、MTA1-ZG29p、MTA2、MTA3 和 MTA3L)［2］。MTA1是這個家族中首先被發現的，已經報道許多人類的腫瘤中MTA1高表達［3］，例如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃腸系統癌癥和結腸直腸癌［4-10］。本研究主要探討胃癌細胞系以及胃癌臨床標本中MTA1的表達情況，以及MTA1在胃癌細胞中的定位情況，為胃癌的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Protein marker購自GenScript公司;MTA1抗體購自Santa公司;HRP標記的羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司;Alexa Fluor 488、DAPI購自Invitrogen公司，ECL發光試劑盒購自GE Healthcare公司;其他試劑均為國產分析純。

1.2 細胞培養

GES1、BGC803、BGC823、SGC7901、MKN1、MKN45、N87、AGS胃癌細胞株均購自于中國科學院細胞庫。細胞均用含有10%胎牛血清的培養基DMEM進行培養，培養至90%融合，進行細胞傳代或用于實驗。

1.3 蛋白提取

1.3.1 細胞蛋白提取 將細胞鋪于6孔板中，培養至90%融合，棄掉培養基，用PBS清洗兩遍，在細胞中加入60μl含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，用橡皮刮刀將細胞緩慢刮下。收集所有液體到新的離心管中，冰上放置10 min，裂解細胞。13 000 g 4℃離心30 min，將上清轉到新的離心管中，取上清5μl，選用G250考馬斯亮藍方法進行蛋白定量。

1.3.2 組織蛋白提取 用剪刀將組織剪成小塊，冰上操作，快速研磨，根據組織塊大小加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，使用細胞超聲破碎儀200 W超聲破碎5次。冰上靜置30 min，13 000 g 4℃離心30 min，將上清轉到新的離心管中，取上清5μl，選用G250考馬斯亮藍方法進行蛋白定量。

1.4 Western blot鑒定

將蛋白定量后取20μg總蛋白經10%SDS-PAGE凝膠分離，4℃過夜40 V恒壓轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h。用MTA1抗體(1∶500稀釋)室溫孵育2 h，然后TBST洗膜3次，每次10 min。再用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠(1∶5 000稀釋)二抗孵育2 h，然后TBST洗膜3次，每次10 min。ECL顯影。

1.5 共聚焦激光掃描顯微鏡觀察MTA1細胞內定位

將胃癌細胞鋪于提前放置好蓋片的12孔板中，24 h后用4%多聚甲醛固定15 min，0.1%TritonX100通透細胞膜15 min，山羊血清封閉1 h，anti-MTA1抗體(1∶50稀釋)室溫孵育 1 h，PBS洗 3次，每次10 min，Alexa Fluor 488(1∶100 稀釋)，室溫孵育 1 h，PBS洗3次，每次10 min，DAPI(1∶1 000 稀釋)，室溫孵育20 min，PBS洗3次，每次10 min，使用50%甘油封片。在激光共聚焦顯微鏡下觀察，綠色區域為MTA1蛋白在細胞內的定位，藍色代表細胞核。

2 結 果

2.1 Western blot檢測胃癌細胞系中MTA1蛋白表達的情況

將8種胃癌細胞鋪于6孔板中，24 h后收集細胞，提取蛋白，經SDS-PAGE凝膠電泳，Western blot檢測蛋白表達(圖1)，MTA1蛋白分子質量為82 kDa，GAPDH作為內參，分子質量為36 kDa。在8種胃癌細胞株中，有6種胃癌細胞表達MTA1。

圖1 Western blot檢測胃癌細胞系中MTA1蛋白表達的情況Fig 1 The expressions of MTA1 were detected by Western blot in the gastric cancer cell lines

2.2 MTA1在胃癌細胞內的定位

通過共聚焦激光掃描顯微鏡觀察MTA1在SGC7901細胞(圖2)和 BGC823細胞(圖3)內的定位，激發光分別為488 nm(綠色)和340 nm(藍色)。

2.3 胃癌組織中MTA1蛋白表達的情況

提取組織蛋白，取20μg總蛋白，經SDS-PAGE凝膠電泳，Western blot檢測蛋白表達(圖4)，MTA1蛋白分子質量為82 kDa，GAPDH作為內參，分子質量為36 kDa，N代表癌旁正常組織，T代表腫瘤組織。11例胃癌標本中有7例高表達MTA1，高表達MTA1比例為63.6%。

圖2 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察MTA1在SGC7901細胞內的定位Fig 2 Confocal microscopy pictures of SGC7901cells show the subcellular localization of MTA1

圖3 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察MTA1在BGC823細胞內的定位Fig 3 Confocal microscopy pictures of BGC823 cells show the subcellular localization of MTA1

圖4 Western blot檢測胃癌組織中MTA1蛋白表達的情況Fig 4 The expressions of MTA1 were detected by Western blot in the gastric cancer tissues

3 討 論

MTA1是1993年Pencil等［11］應用差異雜交從具有轉移潛能的鼠乳腺癌細胞株13762NF中篩選得到的基因。因該基因的表達與乳腺腫瘤轉移能力正相關，故命名為MTA1。人MTA1編碼715個氨基酸，分子量為82 kDa。MTA1蛋白羧基末端富含脯氨酸，其696～705氨基酸殘基序列為LPPRPPPPAP，與SH3結合域 XPXXPPPFXP 或 XpFPpXP 完全配對［12］，為MTA1與信號分子相互作用提供生物化學的基礎［13］。

MTA1包含兩個二連的核定位信號和一個富含堿性氨基酸的核定位信號［13］。一般而言，MTA蛋白包含堿性的核定位信號，主要定位在細胞核中。通過對小鼠組織的分析，MTA1蛋白存在于多種器官中，包括肺、肝、腎、睪丸，MTA1蛋白的水平是變化的，但是容易檢測到，并且提示MTA1在正常的細胞中執行著生理功能［9］。同樣，MTA1免疫組織化學的分析證明了在不同的癌組織中MTA1主要定位在核，包括卵巢癌、肺癌、胃癌、結腸直腸癌［13］。但是在肝癌細胞和B細胞淋巴瘤中，MTA1在細胞核和細胞質中都有定位［14］。本研究在8種胃癌細胞中探測MTA1的表達情況，結果顯示只有GES1和MKN45兩種細胞不表達MTA1。繼而選擇表達MTA1，并且形態較好適合作免疫熒光實驗的SGC7901和BGC823兩種細胞，觀察MTA1的定位情況，發現在這兩種細胞中MTA1主要定位在細胞核中。

轉移是癌癥患者發病和致死的主要原因，在以細胞為基礎的模型和小鼠模型已經確切地證實了MTA1在癌癥轉移中的重要作用［13］。例如在小鼠乳腺上皮組織中MTA1過表達，能夠導致乳腺癌的發生［15］。除了乳腺癌以外，子宮內膜癌微點陣分析，包含70例不同分級的子宮內膜腺癌，其中53例(75.7%)MTA1表達增加［7］。在胃癌的研究中，34例胃癌患者13例(38.2%)MTA1 mRNA高表達。這些發現提示，漿膜侵襲和淋巴結轉移與MTA1高表達密切相關，并且更容易發生血管侵襲，侵襲轉移是惡性腫瘤的重要生物學行為［16］。不同的實驗室和實驗方法已經證明了MTA1與許多癌癥的發生發展有密切關系，在結腸癌患者中MTA1與淋巴結轉移相關，研究發現，MTA1表達水平與某些惡性腫瘤發生、進展、血管生成、轉移、侵襲能力及預后密切相關［17］。在關于癌癥進展的研究中，MTA1已經成為非常重要的分子之一［3］。本研究中11例胃癌臨床標本中檢測發現有7例存在MTA1高表達，胃癌組織與癌旁正常組織相比，MTA1表達升高，比例達到63.6%。綜上所述，我們認為MTA1將成為癌癥治療的重要靶點。

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