環氧合酶-2抑制劑聯合苦參堿逆轉K562/AO2細胞多藥耐藥的研究

桂琳，李靜，陳寶安，高峰，王筠，蔡曉輝

(1.東南大學醫學院附屬蚌埠第三人民醫院血液科，安徽蚌埠 233000;2.東南大學附屬中大醫院血液科，江蘇南京 210009)

白血病的多藥耐藥是導致臨床上白血病化療失敗的主要原因之一，已經證實人P-糖蛋白(P-gp)的過表達與腫瘤的多藥耐藥的發生密切相關。最近已有報道顯示，環氧合酶-2(COX-2)和腫瘤細胞的多藥耐藥基因(multidrug resistance associated protein，MRP)1表達可增加MDR1基因產物P-gp的表達［1］。COX-2是前列腺素合成過程中的一個主要限速酶，在多種上皮來源的腫瘤組織中高表達，而在正常組織中幾乎不表達。有研究表明，COX-2過表達與實體瘤多藥耐藥密切相關，是實體瘤多藥耐藥重要的促進因素，但其確切的機制尚不清楚［2-3］。本研究通過四甲基偶氮唑鹽(MTT)法、流式細胞術、RT-PCR和Western blotting方法檢測COX-2抑制劑塞來昔布、苦參堿單獨及聯合應用對細胞凋亡，MDR1、P-gp等表達變化的影響，探索COX-2與腫瘤多藥耐藥的關系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

RPMI-1640培養基購自Gibco公司，青霉素和鏈霉素均為華北制藥股份有限公司產品，塞來昔布為南京德寶生化器材有限公司提供，苦參堿注射液由遼寧玉皇藥業有限公司提供，阿霉素(ADM)為浙江海正藥業產品，MTT由美國Sigma公司提供，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒是進口分裝產品(原晶美產品)，RT-PCR試劑盒是Fermentas公司產品，COX-2單抗和P-gp單抗均為Abcam產品，COX-2基因、MDR1和GAPDH等引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成(序列查自PubMed)。COX-2上游為TCTGAAACCCACTCCAAACAC，下游為 GCCCTCGCTTATGATCTGTC。MDR1上游為TGGTTTGATGTGCACGATGTTGGG，下游為 AGATCAG CAGGAAAGCAGCACCTA。GAPDH(614 bp)上游為GCCACATCGCTCAGACAC，下游為CATCACGCCACAG TTTCC。

1.2 細胞與細胞培養

人慢性粒細胞白血病急性紅白血病變細胞敏感株K562由本實驗室長期保存，耐藥細胞株K562/AO2細胞是經ADM逐步誘導、具有多藥耐藥MDR表型的穩定細胞系，由中國醫學科學院血液學研究所提供。K562/AO2細胞維持增殖的ADM終濃度為1.0 mg·L-1。將細胞接種于含體積分數為10%小牛血清的RPMI-1640培養液，置于37℃、體積分數為5%CO2飽和濕度培養箱中，2～3 d傳代1次。選取對數生長期細胞進行實驗，實驗前無藥培養3 d。

1.3 實驗分組

實驗時取對數生長期細胞，計數活細胞數在98%以上，根據實驗設計分組:(1)K562陰性對照組(未加藥);(2)K562/AO2陽性對照組(未加藥);(3)ADM干預的K562/AO2組;(4)苦參堿干預的K562/AO2組;(5)塞來昔布干預的K562/AO2組;(6)苦參堿聯合塞來昔布干預的K562/AO2組;(7)苦參堿聯合ADM干預的K562/AO2組;(8)塞來昔布聯合ADM干預的 K562/AO2組;(9)苦參堿、塞來昔布聯合ADM干預的K562/AO2組。

1.4 MTT法檢測細胞毒性作用

取對數生長期人慢性粒細胞白血病急性紅白血病變細胞敏感株K562及其耐藥細胞株K562/AO2分別調整細胞濃度至約2×105ml-1，以每孔200μl接種于96孔細胞培養板中，在CO2體積分數為5%、飽和濕度、37℃孵箱中常規培養。2～4 h后加入不同濃度藥物，每組設3個復孔，培養24或48 h后加入20μl MTT，繼續培養4 h，棄上清，每孔加150μl二甲基亞砜(DMSO)，充分溶解結晶物，平板振蕩儀振蕩10 min，用酶聯免疫檢測儀測定波長492 nm時的OD值，計算細胞抑制率，求出半數抑制劑量(IC50)。藥物對細胞生長抑制率=(1-實驗組吸光度A/對照組吸光度A)×100%;耐藥倍數=耐藥細胞IC50/敏感細胞IC50;增敏倍數=耐藥細胞IC50/加逆轉劑后IC50。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率

將細胞懸液密度調成8×104ml-1，分別加入ADM、苦參堿、塞來昔布以及苦參堿聯合塞來昔布、ADM。另設對照組(未加藥)，置37℃、體積分數為5%CO2的培養箱中培養48 h后1 ml冷PBS離心洗滌2 次(1 500 r·min-1，5 min)，倒掉上清液，加入 500 μl結合緩沖液和5μl Annexin V-FITC重懸后室溫下避光放置20 min，然后用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。每組實驗重復3次，取均數。

1.6 RT-PCR方法檢測MDR1、COX-2 mRNA

分別收集經ADM、苦參堿、塞來昔布單獨及聯合應用后48 h的K562/AO2的各組細胞及對照組細胞。用Trizol法提取各組總RNA，然后利用RT-PCR試劑盒進行逆轉錄反應生成cDNA，并取一定量cDNA加入目的基因引物片段進行PCR反應生成目的DNA基因復制產物，從而半定量測定目的基因mRNA的表達，未反應cDNA保存于-20℃。本實驗PCR體系總體積為25μl，反應條件:94℃預變性2 min;94℃變性30 s，退火30 s(內參GAPDH退火溫度為53℃，MDR1和COX-2基因退火溫度為55℃)，72℃延伸1 min，30個循環;72℃延伸7 min。以MDR1/GAPDH DNA和COX-2/GAPDH DNA光密度比值作為各組實驗資料;每組實驗重復3次，取均值。

1.7 Western blotting法檢測細胞P-gp和COX-2蛋白的表達

分別收集經ADM、苦參堿、塞來昔布單獨及聯合應用后48 h的K562/AO2的各組細胞及對照組細胞后提取蛋白質，BCA法(BCA試劑盒購自碧云天公司)測定蛋白質含量。等量蛋白質采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)進行分離，然后轉至PVDF膜上，室溫下搖動封閉4 h后加入鼠抗人COX-2和P-gp抗體，在4℃過夜，室溫下洗膜后加入堿性磷酸酶標記的羊抗小鼠IgG抗體，室溫孵育1 h;洗去未結合的二抗，加新鮮配置的顯色液，避光顯色20 min后終止反應。P-gp和COX-2蛋白表達值為條帶的灰度值除以β-actin內參校正;每組實驗重復3次，取均值。

1.8 統計學處理

數據用±s表示，兩樣本均數比較用方差檢驗，采用統計軟件SPSS 11.5進行統計學處理。顯著性檢驗采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 逆轉劑及逆轉劑處理前后對K562細胞和K562/AO2細胞的毒性作用

ADM對K562/AO2細胞和K562細胞的IC50分別為 (33.31 ±2.51)、(0.40 ±0.03)μg·ml-1，耐藥倍數為83.69倍?？鄥A對 K562的IC50為(1 290.33±53.45)μg·ml-1，對 K562/AO2 的 IC50為(1 342.33 ±33.50)μg·ml-1，塞來昔布對K562的IC50為 (45.97±1.05)μg·ml-1，對 K562/AO2 的 IC50為(45.68 ±0.15)μg·ml-1，二者差異無統計學意義?？鄥A在≤225 μg·ml-1，塞來昔布在≤11.5 μg·ml-1時對細胞無明顯毒性作用(對細胞的生長抑制率＜10%)。我們選用苦參堿200μg·ml-1、塞來昔布7.5μg·ml-1為單獨及聯合用藥時的逆轉濃度，通過實驗發現二者聯用時毒性并沒有增加。苦參堿(200μg·ml-1)及塞來昔布(7.5μg·ml-1)單獨及聯合應用于K562/AO2細胞時，ADM 對 K562/AO2細胞的 IC50分別為 9.44、12.84、2.71 μg·ml-1，逆轉倍數分別為 3.53、2.60、12.29倍。而對K562細胞IC50值并無明顯影響(圖1)。

圖1 各組藥物干預48 h后對K562/AO2細胞的抑制率

2.2 流式細胞術檢測細胞凋亡率

225μg·ml-1苦參堿及11.5 μg·ml-1塞來昔布單獨及聯合應用，對于K562/AO2細胞均沒有明顯的毒副作用。我們選定苦參堿200μg·ml-1、塞來昔布7.5 μg·ml-1、ADM 2 μg·ml-1為作用濃度，對于K562/AO2細胞其陽性對照組凋亡率為(3.25±0.53)%，單用ADM組凋亡率為(4.81±1.25)%，苦參堿聯合ADM組其凋亡率為(15.31±1.07)%，塞來昔布聯合ADM組其凋亡率為(12.72±0.98)%，而苦參堿、塞來昔布與ADM聯合應用時凋亡率為(29.82±0.23)%，可見應用逆轉劑組凋亡率顯著增高，且兩逆轉劑聯合應用時凋亡率最高。見圖2。

圖2 各組藥物干預K562/AO2細胞48 h后對凋亡率的影響

2.3 RT-PCR方法檢測MDR1、COX-2基因

對照組K562細胞和K562/AO2細胞的MDR1 DNA條帶與內參GAPDH條帶灰度比值分別為(3.72±1.62)%和(127.90±1.78)%，兩組差異有統計學意義(P＜0.05)。對照組K562細胞和K562/AO2細胞的COX-2基因條帶與內參GAPDH條帶灰度比值分別為(1.47±0.86)%和(50.84±2.80)%，兩組差異有統計學意義(P＜0.05)?？鄥A、塞來昔布單獨及聯合應用ADM 48 h后，MDR1與GAPDH的比值分別為(70.76±9.65)%、(78.44±2.36)%和(30.57±5.99)%;苦參堿、塞來昔布單獨及聯合應用ADM 48 h后，COX-2基因與GAPDH的比值分別為(26.42±3.29)%、(24.56±1.13)%和(8.36±2.83)%。加用逆轉劑后與對照組相比有明顯差異，具有統計學意義，以兩個逆轉劑聯用時最明顯。見圖3～5。

圖3 各組藥物干預K562/AO2細胞48 h后COX-2mRNA內參表達的變化

圖4 各組藥物干預K562/AO2細胞48 h后COX-2mRNA表達的變化

2.4 Western blotting法檢測細胞P-gp和COX-2蛋白的表達

對照組K562細胞和K562/AO2細胞的P-gp條帶與內參條帶灰度比值分別為(2.02±0.47)%和(83.72±6.97)%，兩組差異有統計學意義(P＜0.05);對照組K562細胞和K562/AO2細胞的COX-2蛋白條帶與內參條帶灰度比值分別為(1.33±0.48)%和(83.18±5.49)%，兩組差異有統計學意義(P＜0.05)?？鄥A、塞來昔布單獨及聯合應用ADM 48 h后P-gp與內參的比值分別為(51.90±2.57)%、(40.62±4.51)%和(13.30±1.37)%;苦參堿、塞來昔布單獨及聯合應用ADM 48 h后COX-2蛋白與內參的比值為(50.82±6.30)%、(41.19±10.42)%和(13.75±6.12)%。加用逆轉劑后與對照組相比差異具有統計學意義，以兩個逆轉劑聯用時最明顯。見圖6。

3 討 論

化學治療是目前治療惡性腫瘤，包括血液系統惡性腫瘤的主要手段之一?；熯^程中由于多數腫瘤細胞具有遺傳不穩定性，易于突變而產生的MDR是造成化療中斷、導致治療失敗的主要因素之一，也是腫瘤細胞對化療藥物毒性損傷最重要的自我保護防御機制之一。

腫瘤細胞的MDR產生的機制是復雜多樣的，可能的機制主要有:(1)藥物外排;(2)抗細胞凋亡;(3)其他，包括藥物代謝酶活性的變化(如GST、TopoⅡ、PKC)、DNA損傷修復能力增強、微環境耐藥、激素受體量和親和力改變等機制。目前較多的研究表明，腫瘤細胞產生MDR的主要原因是MDR1/P-gp的高表達。因而干預和逆轉腫瘤細胞的MDR，提高化療敏感性對惡性血液病的治療有積極意義［4-5］?？朔嗨幠退幍姆椒ㄖ皇鞘褂媚孓D劑，逆轉MDR能夠使化療失敗的幾率下降具有很高的臨床價值，MDR逆轉已成為目前國內外化療藥物研究的重要方向之一。

圖5 各組藥物干預K562/AO2細胞48 h對MDR1mRNA表達的影響

圖6 各組藥物干預K562/AO2細胞48 h蛋白表達情況

近年來的研究發現許多癌前病變和惡性腫瘤有COX-2的過度表達，COX-2同時具有環氧化物酶和過氧化物酶兩種酶的活性，在腫瘤細胞的惡性進程中對細胞周期、細胞凋亡、腫瘤血管形成以及腫瘤的浸潤、轉移等均存在一定的關聯性［6-7］。COX-2促進腫瘤發生的分子機制主要有:(1)促進腫瘤新生血管的生成;(2)刺激腫瘤細胞的增殖;(3)抑制腫瘤細胞的凋亡;(4)促進腫瘤的浸潤和轉移;(5)抑制機體的免疫反應;(6)參與前致物的活化。目前，COX-2及其抑制劑已成為抗腫瘤研究的又一熱點，有研究報道COX-2抑制劑對細胞增殖的影響作用途徑之一可能是通過調節P-gp的表達來實現［8］。COX-2抑制劑用于實體瘤的多藥耐藥研究已有報道，用于血液系統惡性腫瘤的多藥耐藥的研究報道不多。本研究將基于近年來應用單藥苦參堿或COX-2抑制劑塞來昔布逆轉腫瘤耐藥的基礎上采用兩藥聯合應用的方法，進一步觀察兩藥聯合用于血液腫瘤時對多藥耐藥的影響。因中藥本身具有抗癌作用或者可以通過調節機體免疫功能等協同化療藥物殺死腫瘤細胞，且中藥又具有來源廣泛、價格低廉、毒副作用小等特點，我們選用中西藥聯合作為逆轉劑，通過兩種藥物的協同作用可以使單藥的劑量減小，在獲得更好的治療效果的同時減少了毒副反應。

本研究中MTT法實驗結果顯示:苦參堿≤225μg·ml-1、塞來昔布≤11.5μg·ml-1對K562細胞系和K562/AO2細胞系均無直接細胞毒性。苦參堿200μg·ml-1、塞來昔布7.5μg·ml-1能明顯增強 ADM對 K562/AO2細胞系的殺傷作用。流式細胞術檢測細胞凋亡的實驗結果表明苦參堿≤225μg·ml-1、塞來昔布≤11.5μg·ml-1能顯著增加ADM(2μg·ml-1)對K562/AO2細胞的凋亡率，單獨應用 ADM時其凋亡率為(4.81±1.25)%，苦參堿聯合 ADM時凋亡率為(15.31±1.07)%，塞來昔布聯合ADM時凋亡率為(12.72±0.98)%，苦參堿和塞來昔布聯合ADM時凋亡率為(29.82±0.23)%。RT-PCR實驗結果顯示，K562/AO2細胞系的MDR1和COX-2mRNA高表達?？鄥A、塞來昔布單獨加用ADM作用時均可不同程度地使MDR1和COX-2mRNA表達下調，聯合應用時下調明顯，且MDR1和COX-2mRNA的表達具有明顯的一致性。在Western blotting法檢測細胞P-gp和COX-2蛋白表達的實驗中顯示了和RT-PCR實驗一致的結果。本研究顯示的化療藥物可通過誘導COX-2的表達以及COX-2的表達與P-gp表達的相關性結果，為MDR產生機制的研究提供新的方向，且對MDR的逆轉開辟了新的思路，COX-2選擇性抑制劑的使用可能成為臨床上逆轉MDR的選擇之一，有望提高抗腫瘤藥物療效。

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