助陽寧神方拮抗皮質(zhì)酮致抑郁作用機制實驗研究

戴建國，王中立，陳琳，趙玉男，詹，黃玉芳

(南京中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)科，江蘇南京 210046)

助陽寧神方基于中醫(yī)臨床“助陽入腦，降火寧神”抑郁癥治療思想，由南京中醫(yī)藥大學(xué)王旭東教授提出，該方由制附子、淫羊藿、酸棗仁和知母4味中藥組成，前兩者用于“助陽”，后兩者用于“寧神”，分別作用于陰陽兩端，調(diào)節(jié)抑郁癥患者陰陽平衡紊亂。該方經(jīng)國內(nèi)外臨床應(yīng)用，療效顯著。前期動物實驗發(fā)現(xiàn):該方在強迫游泳和強迫懸尾實驗中表現(xiàn)出明顯抗抑郁作用，但該方作用機制尚未明了，為此，本實驗擬對其可能機制展開初步研究。采用5-羥色氨酸(5-HTP)誘導(dǎo)的甩頭模型、育亨賓毒性模型檢測行為學(xué)改變，皮質(zhì)酮皮下注射制備應(yīng)激抑郁動物模型，免疫組化及Western blot檢測給藥前和給藥4周后小鼠海馬星形膠質(zhì)細胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達改變，期望初步明確其治療機制，并能為該方的臨床應(yīng)用提供理論實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 成年健康雄性C57BL/6N小鼠，體重18～22 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號 SCXK(滬)2007-0005。飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心恒溫恒濕動物房，明暗交替時間為12 h，動物可以自由飲食進水。

1.1.2 藥物、試劑 皮質(zhì)酮購自Sigma公司，批號079K1594;氟西汀由蘇州制藥有限公司生產(chǎn)，批號8146B。5-HTP、帕吉林和育亨賓均購自Sigma公司。其他試劑均為分析純，購自南京化學(xué)試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備 皮質(zhì)酮皮下反復(fù)注射復(fù)制抑郁小鼠模型參考Zhao等［1］的研究。首先將皮質(zhì)酮溶于二甲基亞砜(DMSO)中作為儲液，根據(jù)所用藥水煎劑灌胃給予動物，給藥劑量由人臨床常規(guī)用量換算成小鼠用量，設(shè)置助陽寧神方高(7.6 g·kg-1)、中(3.8 g·kg-1)、低劑量(1.9 g·kg-1)組。陽性藥物氟西汀根據(jù)臨床使用劑量，換算成小鼠用量為3.6 mg·kg-1。注射用帕吉林液由滅菌去離子水配成10 mg·ml-1液體，現(xiàn)配現(xiàn)用。注射用5-HTP由生理鹽水配成濃度為1 mg·ml-1液體，置于-20℃冰箱備用。

1.2.2 生藥水煎劑的制備及給藥劑量 生藥在砂鍋中浸泡30 min，武火煮沸后文火煎煮20～30 min，濾出藥汁，反復(fù)3次，混合藥汁，濃縮即得，生藥質(zhì)量濃度計為 g·ml-1。

1.2.3 分組 根據(jù)小鼠體重隨機分為6組(每組8只)，即模型組，正常組，氟西汀組，助陽寧神方高、中、低劑量組。除正常組外其他各組均給予造模處理。給藥與造模同時進行，正常組和模型組給予蒸餾水，其他各組給予相應(yīng)劑量助陽寧神方。實驗共進行4周，第4周后處死小鼠，行免疫組化及Western blot檢測。

1.2.4 免疫組化染色 實驗完成后給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，打開胸腔，左心室插管，剪開右心耳，用預(yù)溫的37℃生理鹽水約20 ml快速沖洗，再以預(yù)冷的10%多聚甲醛灌注固定30 min后斷頭取腦，放入盛有相同10%多聚甲醛的瓶中固定24 h，利用小鼠腦模具將各組小鼠腦組織切割成等大的包含海馬區(qū)域的腦片，浸泡于30%蔗糖水中，待腦片沉入液體底部，取出應(yīng)用冰凍切片包埋劑包埋，冰凍切片。漂染法進行兩步法免疫組織化學(xué)染色，具體操作流程如下:(1)滴加正常羊血清封閉，室溫30 min。(2)3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，室溫15 min。(3)兔抗GFAP(1∶1 000)，4℃過夜。(4)聚合物羊抗兔IgG，37℃1 h。(5)使用DAB顯色試劑盒顯色，鏡下控制反應(yīng)時間。在步驟(3)、(4)、(5)后均用0.01 mol·L-1PBS 漂洗3次，每次5 min。陰性對照試驗:省去一抗，用正常羊血清代替一抗。每組選取5張切片，每張3個視野，使用圖像分析系統(tǒng)Imagepro-Plus統(tǒng)計每個視野中陽性細胞面積及總光密度值。

1.2.5 Western blot檢測 雙側(cè)海馬組織用1 ml的RIPA 緩沖液［50 mmol·L-1Tris-HCl、0.1%SDS、1%NP-40、1 mmol·L-1EDTA、150 mmol· L-1NaCl、1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF)、1 mg·L-1抑肽酶、1 mg·L-1亮抑肽酶，去離子水配置，pH 7.5］勻漿，12 000 r·min-1離心后取上清液。對所得上清液進行蛋白定量以確定電泳時樣品的上樣量，然后按比例加入上樣緩沖液［1%SDS、1% 二硫蘇糖醇(DTT)、10 mmol· L-1Tris-HCl、10% 甘 油、1 mmol· L-1EDTA、0.2%溴酚藍，去離子水配置，pH 8.0］，混合后在95℃水浴中變性5 min。變性的樣品液經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，濕法將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜成功后，用PBST(含0.05% 吐溫-20的PBS液)稍加漂洗后放入封閉液(含5%脫脂奶粉的PBST液)中，37℃振蕩1 h。封閉結(jié)束后，一抗室溫輕搖孵育2 h或4℃靜置過夜。PBST漂洗3次(每次5 min)后，二抗室溫孵育1 h。PBST再次漂洗3次，采用化學(xué)發(fā)光法，暗室曝光顯影膠片。最后，將膠片上目的條帶掃描進電腦，用Bandscan軟件進行灰度分析。

1.2.6 5-HTP誘導(dǎo)的甩頭行為模型 實驗分為正常組，氟西汀組，助陽寧神方高、中、低劑量組(劑量同上)，共5組，每組10只ICR小鼠。按100 mg·kg-1的劑量皮下注射帕吉林液(10 ml·kg-1)，90 min后按10 mg·kg-1的劑量腹腔注射5-HTP，在連續(xù)給藥7 d后第15 min分別記錄各組小鼠甩頭行為次數(shù)。

1.2.7 育亨賓毒性模型 動物分組、動物數(shù)與給藥同“1.2.6”。按2.5 mg·kg-1的劑量腹腔注射育亨賓(10 ml·kg-1)，注射1 h后觀察各組死亡小鼠只數(shù)。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料用±s)表示，多組比較采用單因素方差分析;計數(shù)資料采用卡方檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 海馬GFAP表達結(jié)果

2.1.1 Western blot檢測GFAP表達結(jié)果 與正常組相比，模型組小鼠海馬組織內(nèi)GFAP表達明顯下降(P＜0.01);與模型組比，氟西汀組和助陽寧神方高、中、低劑量組均能上調(diào)GFAP表達(均P＜0.05)。見圖1。

圖1 GFAP的Western blot檢測結(jié)果Fig 1 The results of GFAP by Western blot

2.1.2 GFAP免疫組化表達結(jié)果 在海馬CA3區(qū)和CA1區(qū)，與正常組比，模型組GFAP陽性區(qū)域總光密度值和面積均明顯下調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)，與模型組比，助陽寧神方高、中、低劑量組均能顯著上調(diào)GFAP陽性區(qū)域總光密度值(P＜0.05或P＜0.01);在CA3區(qū)助陽寧神方高、中劑量組及在CA1區(qū)助陽寧神方中劑量組GFAP陽性表達區(qū)域面積明顯上調(diào)(P＜0.05或P＜0.01);在DG區(qū)，各組GFAP陽性表達區(qū)域面積均無明顯上調(diào)(P＞0.05)，但GFAP陽性表達區(qū)域總光密度值明顯上調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)。見圖2、3。

圖2 海馬陽性區(qū)域面積結(jié)果Fig 2 The positive results of hippocampus area

圖3 海馬陽性區(qū)域總光密度值結(jié)果Fig 3 Hippocampal positive regional total optical density value result

2.2 5-HTP誘導(dǎo)的甩頭模型結(jié)果

鹽酸氟西汀可高選擇性抑制突觸前膜對5-羥色胺(5-HT)的再攝取，提高中樞濃度，能明顯增加5-HTP誘導(dǎo)的小鼠甩頭行為次數(shù)，因此，與正常組(67±18.92)比，氟西汀組小鼠甩頭行為次數(shù)顯著增加(416.5±125.96，P＜0.01);而助陽寧神方高、中、低劑量組小鼠甩頭次數(shù)均未明顯增加(61.4±14.28，48.25±11.96，57.6±10.74，均P＞0.05)。見圖4。

圖4 給藥后不同組5-HTP誘導(dǎo)的甩頭次數(shù)(n=10)Fig 4 The results of head-twitching behavior in different groups after administration

2.3 育亨賓毒性模型實驗結(jié)果

育亨賓毒性模型中，與正常組小鼠死亡1只相比，氟西汀組死亡5只，小鼠死亡率顯著增加(P＜0.05)，而助陽寧神方高、中、低劑量組死亡小鼠數(shù)依次是2、1、1只，與正常組比，小鼠死亡率無顯著性增加(均P＞0.05)。

3 討 論

抑郁癥是一種以心境低落為主要特征的情感性精神障礙，其發(fā)病率逐年升高。據(jù)WHO報道，目前抑郁癥已成為世界第四大疾患，到2020年可能成為僅次于缺血性心臟病的第二大疾病，因此，其防治研究備受關(guān)注。臨床常用的抗抑郁藥多為基于抑郁癥發(fā)病機制的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說，即通過調(diào)節(jié)突觸間隙單胺類神經(jīng)遞質(zhì)來發(fā)揮療效。張杰等［2］研究了醫(yī)院銷售金額、用藥頻度等數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)抗抑郁藥中選擇性5-HT再攝取抑制劑應(yīng)用占主導(dǎo)地位。然而該類藥物對部分患者療效欠佳，因此，探索新的有效治療藥物和方法逐漸成為研究熱點。如張曉斌等［3］就應(yīng)激以及氟西汀對抑郁模型大鼠海馬區(qū)GDNFmRNA表達影響進行探討，期望通過對抑郁癥與星型膠質(zhì)細胞的關(guān)系研究可進一步理解抑郁癥的病理生理機制以及新型抗抑郁藥物的作用機理。

在5-HTP誘導(dǎo)的甩頭行為模型中發(fā)現(xiàn)，與正常組比，助陽寧神方高、中、低劑量組小鼠甩頭次數(shù)無明顯增多(P＞0.05)，而氟西汀組(5-HT再攝取抑制劑)卻可通過高選擇性抑制突觸前膜對5-HT的再攝取提高中樞濃度，能明顯上調(diào)5-HTP誘導(dǎo)小鼠的甩頭行為次數(shù);育亨賓毒性模型實驗結(jié)果顯示，助陽寧神方高、中、低劑量組小鼠死亡只數(shù)未見明顯增加(P＞0.05)，因此推測，該方抗抑郁作用可能不是通過影響單胺類神經(jīng)遞質(zhì)而產(chǎn)生，其機制值得進一步研究。

本實驗抑郁動物模型采用 Zhao等［1，4］的方法，該模型穩(wěn)定，方法簡單，制備容易，重復(fù)性好，目前已被國內(nèi)外大量使用于抗抑郁藥物的篩選，為此，本實驗采用該模型。陳紅霞等［5］認為海馬神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞共同參與了抑郁癥發(fā)生，胍丁胺和氟西汀可逆轉(zhuǎn)慢性應(yīng)激引起的細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，發(fā)揮抗抑郁作用。Banasr等［6］認為僅星形膠質(zhì)細胞丟失就足以引起抑郁癥產(chǎn)生。說明星形膠質(zhì)細胞在抑郁癥產(chǎn)生中起重要作用。GFAP作為星形膠質(zhì)細胞特性骨架蛋白，為星形膠質(zhì)細胞獨有，其表達高低反映了星形膠質(zhì)細胞的活性。本組實驗發(fā)現(xiàn)在皮質(zhì)酮應(yīng)激模型上，模型組GFAP表達下調(diào)，說明星形膠質(zhì)細胞活性下降，而助陽寧神方高、中、低劑量組均能上調(diào)GFAP表達。免疫組化結(jié)果顯示，模型組GFAP陽性表達總光密度值明顯下調(diào)，助陽寧神方各組均能上調(diào)海馬CA1、CA3、DG區(qū)GFAP陽性表達總光密度值;CA1、CA3區(qū)GFAP陽性表達區(qū)域面積也上調(diào)，說明助陽寧神方水煎劑能上調(diào)星形膠質(zhì)細胞活性。因此，助陽寧神方可能通過上調(diào)星形膠質(zhì)細胞的活性而發(fā)揮抗抑郁作用。

綜上所述，助陽寧神方拮抗小鼠抑郁樣作用可能不是通過影響單胺類神經(jīng)遞質(zhì)產(chǎn)生，而是可能與調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞的活性有關(guān)，但其確切機制尚有待進一步研究。

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