一種高效的小鼠肺單細胞懸液制備方法的研究

劉軍，張朋書，于晴，邱海波

(東南大學附屬中大醫院 ICU，江蘇南京 210009)

小鼠由于來源廣泛、免疫及遺傳背景清楚、基因與人類相似、價格便宜、所需試劑的量相對較小，是急性肺損傷(ALI)、肺部感染、哮喘、肺氣腫、肺纖維化等肺部疾病動物模型中常用的動物［1］。制備小鼠肺單細胞懸液為近年一些實驗室常用的技術，是肺細胞生物學研究的前提。實體肺組織單細胞懸液的制備較為困難，獲得產率高、活性高、功能強的單細胞對于進一步的實驗研究十分必要，而細胞數量不足、細胞碎片過多、細胞粘連成團等均可導致整個實驗的失敗［2］。近年來，盡管小鼠作為模式動物在生物醫學研究中的優勢越來越明顯，但目前有關肺單細胞懸液制備的報道較少，尤其是動物實驗中小鼠肺組織量極少(成年小鼠肺組織僅約100～150 mg)，如何應用少量小鼠肺組織制備足量的肺單細胞懸液以進一步進行實驗研究值得關注。

目前常見的分散組織以制備單細胞懸液的方法有機械法和化學(酶消化)法［3］。現在分離組織單細胞懸液常用的有以下方法:機械法，適宜于一些纖維成分很少的軟組織，但該方法對組織損傷較大，易引起細胞損傷和丟失;酶消化法，適宜于含結締組織成分多的標本，所需的組織需要量少，但酶可消化細胞膜上的某些成分［3］。機械分離法簡單，但由于分離組織不徹底、含有組織塊較多、分離的細胞數量偏少等原因，現已較少采用，宜根據組織類型、研究目的及要求選擇恰當的方法和試劑。制備小鼠肺單細胞懸液是非常重要的一個實驗環節，對于研究肺部疾病的細胞學機制，探討防治策略具有重要意義。本實驗應用少量的小鼠肺組織，采用膠原酶Ⅴ酶消化法成功制備了小鼠肺單細胞懸液，并應用細胞計數和流式細胞術等對其進行了鑒定。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級健康雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質量18～22 g，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供［合格證號:蘇SCXK(軍)2007-004］。

1.1.2 主要試劑及配制 Ⅴ型膠原酶和臺盼藍均購自Sigma公司，Hank's平衡液、PBS液和紅細胞裂解液由碧云天生物技術研究所提供，牛血清白蛋白購自Roche公司。

應用Hank's平衡液以175 U·ml-1濃度配制膠原酶Ⅴ消化液，牛血清白蛋白使用時以新鮮配制的PBS液配制為1%濃度。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠肺的采集 小鼠處死，75%醫用乙醇消毒局部皮膚，無菌操作打開胸腔取出肺臟并移入平皿中，無菌PBS清洗肺組織表面的血液及血凝塊，去除氣管和支氣管。

1.2.2 膠原酶Ⅴ消化法制備肺單細胞懸液 取30 mg肺組織，無菌狀態下應用眼科剪將肺組織輕柔剪成1～2 mm3小塊，然后用勻漿機勻漿1 min。將組織加入預熱至37℃的新鮮膠原酶Ⅴ消化液中，置入37℃的水浴箱中，每隔3～5 min輕輕振搖1次。60 min時可見肺組織幾乎全部消化，冰浴終止消化，輕輕吹打分散細胞，收集消化液;200目不銹鋼網過濾;離心(1 000 r·min-1，5 min);去上清，加入PBS輕柔吹打;離心去上清;加入紅細胞裂解液5 ml，冰上孵育10 min;離心去上清;加入PBS吹打，再離心漂洗1～2次，去上清，加入含1%BSA的4℃ PBS2 ml得到小鼠肺單細胞懸液。

1.3 細胞鑒定

1.3.1 細胞形態學觀察 光學顯微鏡下觀察肺細胞形態。

1.3.2 細胞計數 吸取少量細胞懸液，加到細胞計數板上，在倒置顯微鏡(10×物鏡)下計數4個大方格內的細胞總數。按公式計算，細胞數目=(4大格細胞數之和/4)×104×細胞原液量(ml)。

1.3.3 細胞活性測定(臺盼藍排斥實驗) 吸取9滴細胞懸液，加入1滴0.4%臺盼藍，混勻后在3 min內計數活細胞和死細胞數量，計數細胞活性率。藍染細胞為死亡細胞，活細胞不著色。計數200個細胞，計算出活細胞百分率。

1.3.4 流式細胞術檢測肺細胞懸液 取小鼠肺單細胞懸液樣本，離心去上清，加入0.5 ml PBS溶液，混勻后應用流式細胞儀檢測分析。

2 結 果

2.1 細胞形態

光鏡下，膠原酶Ⅴ消化法所得小鼠肺細胞多種多樣、大小不一，但細胞形態完整、邊界清晰、分散度好、背景較干凈、雜質及細胞碎片較少、細胞團較少(圖1)。

圖1 分離的小鼠肺細胞圖 ×100Fig 1 Morphology of isolated lung cells in mice ×100

2.2 細胞計數及細胞活性率

膠原酶Ⅴ消化肺細胞產量高、活力好，通常30 mg小鼠肺組織可提取有核細胞數量為(1～4)×106個。肺單細胞懸液中活細胞百分率均在95%以上(圖2)。

圖2 小鼠肺單細胞懸液臺盼藍染色圖 ×400 Note:arrows indicate necrotic cells stained with blueFig 2 Trypan blue staining of lung single cell suspension in mice ×400

2.3 流式細胞術檢測肺單細胞懸液

流式細胞術檢測小鼠肺單細胞懸液見大量的肺細胞(圖3)。

3 討 論

呼吸系統疾病發病率高，在該領域內的實驗性研究已從實驗動物的大體水平漸轉移到單細胞乃至分子水平［4-5］，要從結果復雜的肺組織檢測某種細胞必須對肺組織進行分離，制備肺單細胞懸液是進行細胞體外培養和細胞生物學研究的首要環節，這就需要一種簡單、穩定、高效的肺實質細胞的分離方法，以為科研工作提供高效的平臺。

圖3 小鼠肺單細胞懸液流式細胞圖Fig 3 The representative dot plot showing mice lung single cell suspension

目前分離組織單細胞懸液常用的有以下方法:機械分離法，適宜于一些纖維成分很少的軟組織，但該方法對組織損傷較大，易引起細胞損傷和丟失;酶消化法適宜于含結締組織成分多的標本，所需的組織需要量少，但酶可消化細胞膜上的某些成分［3］。機械分離法簡單，但由于分離組織不徹底、含有組織塊較多、分離的細胞數量偏少等原因現已較少采用。

由于小鼠本身肺組織量少，含結締組織較多，本研究采用酶消化法直接制備肺單細胞懸液。膠原酶僅對細胞間質有消化作用而對實質細胞影響不大，且其消化作用不受一些離子和血清等成分的影響，故本實驗應用膠原酶Ⅴ進行酶消化［3，6］。

本研究結果顯示，應用膠原酶Ⅴ酶消化法制備肺單細胞懸液，光鏡下見細胞大小不一、形態多樣，提示是多種細胞的混合物，可能包括各型上皮細胞、內皮細胞、白細胞、成纖維細胞等。另外，少量肺組織(30 mg)可以獲得(1～4)×106個肺細胞，提示本方法分離少量肺組織獲得的單細胞數量足以滿足一般肺細胞生物學研究的需要，便于施加處理因素，并有利于進行流式細胞術、細胞培養等實驗。

流式細胞術應用于肺組織細胞研究，具有快速、準確、高靈敏、多參數檢測細胞等特點，用流式細胞術對肺組織單細胞各種免疫表型分析都必須基于單細胞基礎之上，肺單細胞懸液樣品制備是其分析的關鍵［2，7］。我們采用流式細胞術鑒定分離的肺細胞，發現肺細胞懸液中有大量的單細胞(圖3)，也證實膠原酶Ⅴ酶消化制備肺單細胞懸液方法高效可靠。被分散的肺組織細胞是多種細胞的混合物，可通過分析熒光標記的特異性抗體表達，進一步檢測某個或某些特定的細胞群。

實體組織單細胞懸液制備比較困難，需注意的事項較多。本實驗中，我們發現以下因素與實驗成功率和分離的細胞數量密切相關:(1)掌握無菌原則。包括取肺、配制試劑等應注意無菌原則，避免滋生一些不必要的細菌，影響到最后的檢測結果。(2)操作動作輕柔。避免損傷組織細胞，盡量減少細胞碎片。(3)不銹鋼網孔徑。不銹鋼網孔徑影響過濾細胞的大小，過大則可能液體中含大量的細胞團塊，孔徑過小會引起大量細胞丟失。(4)離心速度和時間。離心速度過快、時間過長，造成細胞損傷，甚至死亡，同時會擠壓細胞，細胞凝集重新變成團塊狀，不利于均勻分散懸浮，且還會使得在最后的檢測中發現大量殘余的細胞碎片，影響結果;離心速度太慢或時間過短，組織細胞容易懸浮，既不能有效去除碎片，更造成不必要的細胞損失;因此，在離心時要注意離心的速度和時間。(5)膠原酶Ⅴ消化液工作溫度。在膠原酶Ⅴ作用期間要注意保持37℃消化。(6)酶消化液作用時間。時間會影響酶消化效果，本實驗發現，30 mg的肺組織膠原酶Ⅴ在37℃消化1 h，可以取得滿意結果。(7)酶消化液量。一般要求酶消化液容積為肺組織體積30～50倍，本研究在進行酶消化時，一般30 mg的肺組織給予4 ml的膠原酶Ⅴ酶消化液(175 U·ml-1)可取得較好效果。(8)振搖。酶消化時每隔數分鐘輕輕振搖數次以增加酶作用面積，如能放置在37℃的恒溫震蕩水浴箱中更好，如組織塊經振搖后成細胞團或單個細胞，即可認為已消化充分。(9)酶消化液最好臨用時配制，新鮮酶消化液效率高。(10)細胞在保存液中的狀態。不同的細胞其保存液的濃度不同，這就要求調試到最適合濃度以使得細胞在液體中能保持單個的均勻分散的狀態。

總之，應用膠原酶Ⅴ酶消化法制備肺單細胞懸液簡單、高效、穩定，無需進行肺細胞培養卻可以直接得到大量單細胞，非常適合于肺細胞病理、生理變化的研究。

［1］MATUTE-BELLO G，FREVERT C W，MARTIN T R.Animal models of acute lung injury［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2008，295(3):L379-399.

［2］DEMEDTSI K，BRUSSELLE G G，VERMAELEN K Y，et al.Identification and characterization of human pulmonary dendritic cells［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2005，32(3):177-184.

［3］司徒鎮強，吳軍正.細胞培養［M］.西安:世界圖書出版西安公司，2007:53-57.

［4］唐曉媛，于化鵬，鄧火金，等.不同劑量致敏原對小鼠哮喘模型中氣道反應性的變化［J］.現代醫學，2011，39(2):121-125.

［5］顧小軍.實驗性糖尿病酮癥酸中毒家兔Ⅰ型肺泡上皮細胞損傷和修復狀況研究［J］.現代醫學，2011，39(4):393-397.

［6］MARTIN J，DINSDALE D，WHITE I N.Characterization of clara and typeⅡcells isolated from rat lung by fluorescenceactivated flow cytometry［J］.Biochem J，1993，295(1):73-80.

［7］VERMAELEN K，PAUWELSR.Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry:methodology and new insights［J］.Cytometry A，2004，61(2):170-177.