近紅外光譜技術在激光熱療荷瘤大鼠中的實時監(jiān)測研究

王猛，游洋，楊天明，錢志余，包美芳

(1.東南大學附屬中大醫(yī)院神經外科，江蘇南京 210009;2.南京航空航天大學生物醫(yī)學工程系，江蘇南京 210016)

膠質瘤是神經系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，廣義膠質瘤是指所有神經上皮來源的腫瘤，而組織病理學上則狹義地指來源于各類膠質細胞的腫瘤。雖然臨床上膠質瘤的治療有手術、化療、放療、基因、免疫、光動力、熱療、中醫(yī)藥等多種手段［1］，但其總體預后仍不容樂觀。腫瘤激光間質熱療(laser interstitial thermotherapy，LITT)是將激光通過光纖導入到腫瘤組織內部并從加入頭表面發(fā)出，腫瘤組織吸收激光能量而被加熱，由于過熱和凝結效應而壞死［2］。世界范圍內有少數醫(yī)療中心已經將LITT作為腦腫瘤治療方法之一應用于臨床［3-6］。本研究將近紅外光譜(NIRS)技術應用于LITT大鼠膠質瘤并行術中實時監(jiān)測，通過分析NIRS光學參數，尤其是優(yōu)化散射系數(μ's)的變化情況，對膠質瘤的LITT治療進行評估。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

德國LIMO公司半導體激光器電源及CA系列高功率半導體激光器、fNIRS監(jiān)測系統(tǒng)［7］、7.0 T小動物MRI、自動步進系統(tǒng)、計算機及相關軟件。

1.2 細胞和動物

SD健康大鼠100只，體重180～220 g，雌雄不限(購自南京青龍山實驗動物中心)。大鼠C6膠質瘤細胞株。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 將C6細胞分裝于底面積為50 cm2的培養(yǎng)瓶中，加入含有體積分數為10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液，置于溫度為37℃、CO2體積分數為5%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，單層培養(yǎng)法傳代培養(yǎng)生長至所需的細胞數。在細胞對數生長期大約滿90%時，以0.25%胰酶消化，收集消化液，離心后去除上清液，DMEM/F12培養(yǎng)液洗2次后制成細胞懸液，調節(jié)細胞濃度［1×107(10μl)-1～1×108(10μl)-1］，置于34℃恒溫搖床待接種。苔盼藍排斥實驗檢測細胞活力＞95%。

1.3.2 腫瘤接種 SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥(45 mg·kg-1)進行麻醉。麻醉后將大鼠固定于小動物實驗臺上，0.5%碘伏左前腋下局部消毒，25μl微量進樣針將20μl細胞懸液穿刺成功后緩慢注入血供豐富的左前腋區(qū)皮下間隙，注射完畢后無菌敷料覆蓋。

1.3.3 MRI成像 術后1～2周行7.0 T磁場強度MRI掃描，觀察腫瘤生長情況。

1.3.4 近紅外光學參數μ's的測定 將建模成功后的膠質瘤大鼠隨機分為非 LITT 30、60、90、120 s，0.77 W(8.3 A)30、60、90、120 s，1.23 W(8.8 A)30、60、90、120 s，1.88 W(9.5 A)30、60、90、120 s，2.35 W(10 A)30、60、90、120 s組，共20 組，每組 5 只。荷瘤大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(45 mg·kg-1)麻醉，常規(guī)消毒后切開皮膚約1.0 cm，剝離皮下組織，分離出膠質瘤并切開0.5 cm，將固定于步定進機的激光光纖探頭與近紅外探頭一同緩慢步進入腫瘤，開啟近紅外光源，根據分組情況予以808 nm LITT(非LITT組不予只記錄相應時間內的μ's值)，記錄腫瘤在LITT前及過程中μ's的變化，測量結束后緩慢退出激光光纖探頭與近紅外探頭，常規(guī)消毒縫合傷口，整個過程在超凈工作臺內進行，術后予以抗生素防治感染，次日對手術大鼠再次行7.0 T磁場強度的小動物專用MRI掃描。MRI掃描后斷頭處死大鼠，取腫瘤固定于4%多聚甲醛溶液3 d，石蠟包埋，HE常規(guī)染色。

1.4 統(tǒng)計學處理

實驗數據用±s表示，所得數據采用SPSS17.0及Excel軟件進行分析，行單因素或兩因素多樣本均數比較的方差分析，當P＜0.05時認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 建模后大鼠臨床表現

大鼠左上肢皮下可見一逐漸增大類圓形腫物，質硬，活動度好;大鼠左上肢活動輕微受限，進水進食無明顯異常，二便無明顯異常，體重未見明顯減輕，行為無明顯異常。

2.2 術前MRI及病理檢查結果

經7.0 T磁場強度的小動物專用MRI掃描，T2像可見大鼠左上腋皮下一直徑約1.5 cm類圓形高信號影(圖1a)。取膠質瘤組織進行HE染色，可見膠質瘤細胞輕度藍染，細胞核清晰，細胞排列紊亂(圖1b)。

2.3 LITT過程中μ's的測定結果

2.3.1 非LITT組μ's的變化 該組內荷瘤大鼠的μ's在操作過程中保持平穩(wěn)，無明顯波動變化。

2.3.2 0.77、1.23、1.88、2.35 W μ's組 μ's的變化LITT前μ's保持平穩(wěn)，為記錄其平穩(wěn)值，LITT開始后μ's首先出現瞬間小幅下降，預置程序剔除808 nm激光干擾，然后平緩地上升，熱療結束時μ's達峰值，隨后μ's保持平穩(wěn)或緩慢下降。

2.3.3 各組荷瘤大鼠LITT前后μ's的變化值比較荷瘤大鼠μ's會因腫瘤物質的組成不同即病理分級不同而有所差別［11］，所以采用μ's的變化值來進行分析，定義變化值為:每只荷瘤大鼠熱療過程中μ's的峰值與該大鼠LITT手術前初始狀態(tài)的均值的差值，采用5只大鼠變化值的平均值±標準偏差來表示不同組別的光學參數變化情況。由于非熱療組無峰值出現，故不納入統(tǒng)計分析，用“—”表示(表1)。

圖1 大鼠建模成功后影像學及病理學表現Fig 1 Tumor imaging and pathological manifestations

表1 荷瘤大鼠LITT前后μ's的變化cm-1Tab 1 The changes ofμ's before and after LITT for rats with glioma cm-1

結果進行統(tǒng)計學分析:同一功率下不同時間組間兩兩比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);同一時間下不同功率組間兩兩比較，差異亦具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.4 LITT后荷瘤大鼠的影像學及病理學圖像

術后第2天使用小動物專用7.0 T MRI掃描，各組可見明顯片狀類圓形壞死灶，T2WI表現為腫瘤中心低信號影，低信號灶周圍信號略有升高，水腫帶形成(圖2a)。行MRI后取膠質瘤組織進行HE染色，可見腫瘤中心形成明顯壞死灶，表現為膠質瘤細胞完全變性壞死，胞核消失，胞質空泡化;其外為反應區(qū)，胞膜較完整，腫瘤結構依稀可見，周圍有水腫形成(圖2b)。

圖2 荷瘤大鼠LITT后影像學及病理學表現Fig 2 Imaging and pathological manifestations of tumor after LITT

2.5 LITT后荷瘤大鼠壞死灶體積

經病理學驗證，可以將連續(xù)掃描影像學的最大壞死灶直徑測量值作為壞死灶的直徑D(D=2R)，同時測量得壞死灶的高H。利用公式V=4πR2H/3=πD2H/6計算獲得壞死灶體積，體積的數據見表2。

表2 荷瘤大鼠LITT壞死灶體積mm3Tab 2 The volume of necrosis after LITT for rats with glioma mm3

統(tǒng)計結果分析:相同熱療功率下，不同時間組間兩兩比較，熱療壞死灶體積差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，相同熱療時間下，不同功率組間兩兩比較，熱療壞死灶體積差異亦有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

3 討 論

LITT已經用于神經膠質瘤的臨床治療，LITT的功率、時間直接影響治療效果及預后［8-10］，對LITT的術中實時監(jiān)測是十分必要的，因此我們將NIRS技術應用于LITT大鼠膠質瘤，研究NIRS對膠質瘤LITT進行實時監(jiān)測的可行性。生物組織對于近紅外區(qū)域的光(700～1 200 nm)具有相對的透明性，利用近紅外波段光對組織的良好通透性及在不同組織的光學差異性，有望達到對組織結構精確定性、精準測量、精細定位的目的［11-12］。光子進人體組織后主要與組織發(fā)生以下相互作用:(1)吸收，從而導致能量在組織中的喪失，表征這一作用的光學參數稱為吸收系數(absorbtion coefficient，μα);(2)散射，發(fā)生在介質的邊界，如與神經活動相關的神經元的膜表面，是由于在顯微水平上組織中各組成成分的折射率不連續(xù)所致，表征這一作用的光學參數稱為 μ's，它表示散射事件發(fā)生的頻率，或者單位路徑內光子因散射而損失的光能量的比率。由于吸收和散射的作用，光在通過組織后其強度會減小，削減的程度與所通過組織的吸收系數和 μ's的大小有關，因此可以說漫反射或透射光中攜帶著大量的生物組織結構和成分的信息［13］，從漫反射或透射光的光譜信息中了解光在組織中被吸收和散射的情況，從而解算出組織的 μα和 μ's等光學參數，這正是NIRS技術的理論基礎［14］。運用NIRS技術監(jiān)測各功率、時間下 LITT過程中腫瘤組織μ's的變化規(guī)律，并對其加以分析。相同時間、不同功率下，μ's的變化值隨功率變化較明顯，提示組織受損程度不同，術后通過病理學及影像學檢查測得壞死灶的體積及程度確實存在差異，即μ's變化值的大小對應不同的組織損傷程度。相同功率、不同時間下，μ's的變化值隨時間延長而增大，壞死灶的體積也隨之增大，提示熱療時間越長腫瘤組織壞死程度越嚴重。對各組μ's數據、壞死灶體積數據進行統(tǒng)計學處理，功率不變時，各時間組之間存在明顯的統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，時間不變時，各功率組之間亦存在明顯的統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。

MRI、B超等設備雖可用于LITT術中實時監(jiān)測，但靈活性及準確性差，故較少用于術中實時監(jiān)測。劉華亭等［15］證實NIRS參數(μ's)變化與大鼠膠質瘤射頻毀損的溫度、時間具有相關性，本實驗提示升高功率和延長時間μ's發(fā)生了明顯的變化，相對應的探頭周圍腫瘤組織的壞死體積也發(fā)生了明顯的變化，μ's很好地反映了LITT壞死體積的變化情況，故能作為LITT實時監(jiān)測的一個良好指標。

［1］劉偉國.膠質瘤綜合治療進展［J］.實用腫瘤雜志，2004，19(6):462-465.

［2］MENOVSKY T，BEEK J F，van GEMERT M J C，et al.Interstitial laser thermotherapy in neurosurgery:A review［J］.Acta Neurochirurgica，138，(9):1019-1026.

［3］ROUX F X.Laser Interstitial thermotherapy in stereotactical neurosurgery［J］.Lasers in Medical Science，1992，7:121-126.

［4］SCHWABE B，KAHN T，HARTH T，et al.Laser-induced thermal lesion in the human brain:short and long-term appearance on MRI［J］.Comput Assist Tomogr，1997，21:818-882.

［5］LEONARDI M A，LUMENTA CB，GUMPRECHT H K，et al，Stereotaetic guided laser—induced interstitial thermotherapy(SLITT)in gliomas with intraoperative morphologic monitoring in an open MR:clinical experience［J］.Minim Invasive Neurosurg，2002，45:201-207.

［6］JOACHIM-SCHWARZMAIERA H，EICKMEYERB F.MR-guided laser-induced interstitial thermotherapy of recurrent glioblastoma multiforme preliminary results in 16 patients［J］.European Journal of Radiology，2006，59(2):208-215.

［7］李榮，錢志余，戴麗娟.生物組織近紅外光譜自動測試系統(tǒng)［J］.計算機測量與控制，2007，15(2):154-156.

［8］劉斌，雷霆，李齡，等.激光間質熱治療對大鼠腦膠質瘤細胞凋亡的影響［J］.中華實驗外科雜志，2001，18:491-492.

［9］劉守勛，劉昊.膠質瘤激光間質熱療的實驗研究［J］.中華神經外科疾病研究雜志，2002，1(3):209-212.

［10］江世臣，張學學.激光誘導間質腫瘤熱療的數值模擬和實驗研究［J］.工程熱物理學報，2005，(S1):187-190.

［11］郭麗娜，錢志余，李寬正，等.近紅外光譜(NIRS)技術的大鼠膠質瘤活體在位檢測研究［J］.量子電子學報，2008，25(4):483-488.

［12］張正雄，游洋.近紅外光譜技術在膠質瘤大鼠射頻熱療中的應用研究［J］.東南大學學報:醫(yī)學版，2009，28(3):202-206.

［13］HUANGL，TIANF H，DINGH S，et al.The study of methods for measurement tissue oxygenation by using NIRS［J］.J Infrared Milim Waves，2003，22(5):379-383.

［14］趙友全，范世福，曹文新.生物組織光學特性參數及其描述［J］.國外醫(yī)學:生物醫(yī)學工程分冊，2000，23:76-79.

［15］劉華亭，楊天明，錢志余，等.應用近紅外光譜技術對膠質瘤大鼠射頻熱療的實時在位監(jiān)測研究［J］.東南大學學報:醫(yī)學版，2011，30(3):436-440.