加麗素紅中角黃素在雞體內的藥代動力學研究

田 洋 楊蘭蘭 徐昆龍* 肖 蓉 李 棟 何夢恒 史崇穎

(1.云南農業大學食品科學技術學院，昆明 650201;2.云南農業大學動物科學技術學院，昆明 650201)

加麗素紅為瑞士羅氏公司生產的化學合成類飼料著色劑，有效成分為10%的角黃素［1］，主要用于增加家禽皮膚、腳脛、蛋黃以及水產動物體表、肌肉組織的色澤，已被廣泛應用在我國蛋禽飼糧和三黃雞飼糧中，使用率達到60%左右［2］。國內市場上出現的“紅心蛋”就是由于飼糧中添加了加麗素紅致使蛋黃呈現誘人的紅色。隨著一些報紙、網站等新聞媒體對“紅心蛋”各種評論的不斷升溫，加麗素紅在飼料中使用的安全性引起了消費者的高度關注［3］。

角黃素(又叫斑蝥黃，斑蝥黃質，canthaxanthin)為一種非維生素A原酮式類胡蘿卜素，分子式為C40H52O2，相對分子質量為 564.9，化學名稱為β，β'－ 胡蘿卜素 －4，4'－ 二酮［4－5］。2008 年我國農業部公布的第1 126號文件中允許使用的8種著色劑中包含角黃素，并規定了適用范圍為家禽［6］。近年來，角黃素作為飼料著色劑濫用現象日益嚴重，其危害性引起了各國的高度重視，揭示角黃素在動物體內的代謝動力學參數是產生、決定或闡明其毒性大小的基礎。目前國內外關于角黃素在動物體內藥代動力學特征的研究較少，且大部分集中在虹鱒魚等水產動物上，關于對其在家禽體內的藥代動力學特征卻鮮見報道。

本研究利用藥物代謝動力學的方法，通過不同時間測定雞血清中角黃素的質量濃度，求出相應的藥物代謝動力學參數，從而闡明其在雞體內的藥物代謝動力學特征，以期為加麗素紅在毒理學方面的研究及其在畜牧養殖業中合理使用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品

加麗素紅，含10%角黃素，瑞士羅氏公司;角黃素標準品，批號CA10947000，純度為96.0%，德國 Dr.Ehrenstorfer公司;甲醇、乙腈、正丙醇、正己烷、N，N－二甲基甲酰胺、無水硫酸鈉均為色譜純。

1.2 儀器

Vortex genius 3旋渦混勻器，德國IKA公司;3－30K冷凍離心機，德國Sigma公司;TH2－320臺式恒溫振蕩器，上海精宏實驗設備有限公司;Waters2695高效液相色譜儀附紫外檢測器，美國Waters公司;HR2864飛利浦三合一攪拌器，荷蘭皇家飛利浦電子公司;SB3200超聲波清洗儀，美國伯明斯頓公司;BUCHI R－200旋轉蒸發儀，瑞士BUCHI公司;T－4002電子分析天平，美國丹佛儀器公司。

1.3 試驗動物

選用12只健康的19周齡海蘭白殼蛋雞為研究對象，平均體重為(1.25±0.09)kg，購買于云南昆明某雞場。在封閉的動物房，飼養于雛雞籠中，自由飲水和采食。

1.4 試驗飼糧

基礎飼糧為玉米－豆粕型，其組成及營養水平見表1。

1.5 給藥及樣品采集

加麗素紅懸液經口灌胃給予雞的劑量為9.6 mg/kg BW，給藥前禁食12 h，自由飲水。采血時間分別為給藥后的 1、2、4、6、8、10、12、24、36、72 h，翅靜脈采血，血樣置于刻度試管中，放置成斜面，放入 37℃水浴鍋中作用 30 min，然后以4 000 r/min離心10 min，即得血清。血清樣品置－20℃冰箱中保存備用。

1.6 樣品處理

準確吸取血清1.0 mL于50 mL離心管中，加入30 mL乙腈和3 g無水硫酸鈉，旋渦混勻1 min，振蕩10 min，超聲1 min，然后以3 000 r/min離心5 min，將上清液移入預置有20 mL正己烷的分液漏斗中，混勻后靜置分層;收集下層乙腈相。按上述步驟對離心管中殘留物每次用20 mL乙腈再重復提取2次，合并3次提取乙腈相，加入5 mL正丙醇，于40℃以下旋轉蒸發濃縮至干。

準確吸取5 mL乙腈，至于旋轉蒸發瓶內，超聲1 min，充分混勻內容物置于測定瓶內，經0.45μm微孔濾膜過濾后直接上機測定。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.7 數據處理

將試驗所得血藥濃度數據采用中國藥理學數學專業委員會編制的3P97藥物代謝動力學程序軟件，在微機上進行曲線擬合，以Akaike’s信息數據的最小信息準則(AIC)值、殘差平方和(Re)和擬合度(r2)為標準確定最佳房室模型，并計算出藥物代謝動力學參數。試驗數據均以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 雞血清中角黃素質量濃度的測定結果

雞口服給予加麗素紅后角黃素在血清中的質量濃度測定結果見表2。同時測定了不同雞血清中的角黃素質量濃度，其結果標準差較小，說明加麗素紅中角黃素在不同雞體內的代謝過程較為穩定。

表2 雞口服給予加麗素紅(9.6 mg/kg BW)后角黃素在血清中的質量濃度Table 2 Canthaxanthin concentration in serum of chickens following oral administration of Carophyll Red at a dose of 9.6 mg/kg BW

2.2 加麗素紅中角黃素的血藥濃度－時間曲線

雞口服給予加麗素紅后角黃素在其體內的血藥濃度 －時間曲線見圖1。可知，雞口服9.6 mg/kg BW加麗素紅后，首先進入吸收相，給藥后1 h可檢測到角黃素，在0～10 h，血清中角黃素濃度迅速上升，達峰時間為10 h，峰濃度為(0.362±0.015)μg/mL;隨后進入消除相，在10～24 h，血清中角黃素濃度迅速下降到(0.108±0.005)μg/mL，在 24 ～72 h，下降變得緩慢。

圖1 雞口服給予加麗素紅后角黃素在其體內的血藥濃度－時間曲線Fig.1 Serum drug concentration-time curve of canthaxanthin concentration in serum of chickens following oral administration of Carophyll Red

2.3 房室模型的選擇

為驗證房室數，本試驗用Akaike’s信息數據法的AIC值、Re和r2的方法對于一室及二室的契合程度進行了比較(表3)。可知，一室與二室模型比較后的Re值以一室為小，r2值以一室為大，AIC值以一室為小，因此3種方法均表明雞口服加麗素紅后角黃素的血藥濃度－時間數據屬一室模型。

表3 3種方法對角黃素一室及二室契合程度的比較Table 3 Comparison one-compartment model to two-compartment model with three methods

2.4 藥代動力學參數

用3P97藥動學軟件對各時間點血清中角黃素質量濃度進行數據處理后發現(表4)，加麗素紅經雞口服后，角黃素在雞體內的代謝過程可按一室模型一級動力學擬合，其理論方程為C=0.471(e－0.036－ e－0.190)，藥代動力學的主要參數為:吸收半衰期 t1/2(Ka)=(3.643 ±0.205)h，消除半衰期 t1/2(Ke)=(19.263 ±1.312)h，達峰時間Tmax=(10.795 ± 1.007)h，達 峰濃度 Cmax=(0.259±0.048)μg/mL，血藥濃度 － 時間曲線下面積 AUC=(10.607 ±1.029)μg/(mL·h)，總體清除率 CLB=(0.905 ±0.076)L/(kg·h)，表觀分布容積 Vd=(2.515±0.133)L/kg。結果表明角黃素在雞體內吸收迅速，較快達到峰濃度，分布廣泛，消除較慢。

表4 雞口服給予加麗素紅后其角黃素的藥代動力學參數Table 4 Pharmacokinetic parameters of canthaxanthin in chickens following oral administration of Carophyll Red

3 討論

角黃素作為一種飼料著色劑被廣泛用于我國蛋雞飼料中，主要增加雞的腳脛、皮膚以及蛋黃的顏色，使其呈現鮮艷的誘人色澤，增加其商業價值。本試驗選用19周齡已經產蛋的海蘭蛋雞(產蛋的平均周齡為18周)為研究對象，符合角黃素在家禽養殖業中的實際使用情況，因此對于闡明角黃素在雞體內的藥代動力學特征更具有現實意義。

Nierenberg［7］和 Sapuntzakis 等［8］報道了血清中類胡蘿卜素的含量比血漿中類胡蘿卜素的含量高了10%，為了提高試驗過程的準確性和精密度，應選用雞的血清來進行試驗。

本試驗中所得的血藥濃度－時間數據經3P97軟件分析處理，分別按一室、二室模型進行模擬，根據AIC值、Re值和r2值，確定雞口服加麗素紅后，角黃素在體內的代謝過程符合一級吸收一室模型。Gobantes等［9］報道了加麗素紅經口服給予虹鱒魚后，角黃素在其體內也符合一級吸收一室模型，這說明角黃素在不同的動物體內代謝方式基本相似，都為一級吸收一室模型。

Tmax是指藥物經血管外給藥吸收后達到藥峰濃度所需的時間，是反映藥物在體內吸收速率的一個重要指標，與吸收速率常數相比，它能更直觀和準確地反映出藥物的吸收速率，因此更具有實際意義［10］。雞單劑量口服給予加麗素紅后血清中角黃素質量濃度的最高峰出現在10 h，而在虹鱒魚和牛的動物體內達峰時間分別為12和8 h，在人體內達峰時間為 6 h［9，11－13］，這說明角黃素在雞體內的吸收速率要快于虹鱒魚，而慢于牛和人，這可能與動物的種屬有很大關系，但其他的因素也可能會影響這一結果，比如給予藥物的劑型、動物的生長環境(pH和溫度)以及能夠使動物生理狀態發生變化的外界因素等［9］。

t1/2(Ka)是指藥物經口服后消化道吸收了藥物1/2所需要的時間;t1/2(Ke)是指藥物在體內消除1/2所需要的時間，即血藥濃度下降1/2所需要的時間。角黃素在雞體內的t1/2(Ka)比在虹鱒魚中的t1/2(Ka)低了27.29%，而t1/2(Ke)卻比虹鱒魚的t1/2(Ke)高了52.52%［9］，說明角黃素在雞體內吸收迅速，但是消除半衰期卻慢于虹鱒魚;同時Choubert等［14］研究發現角黃素經靜脈注射到虹鱒魚體內后的消除速度要比經口服給予虹鱒魚后的消除速度快約4倍，這可能是由于口服給藥后角黃素要經過胃腸道的吸收后才進入血液循環，延長了角黃素在雞體中滯留的時間。

藥物消除是指促使藥物由體內喪失(代謝和排泄)的各種過程的總和。角黃素作為一種非維生素A原的類胡蘿卜素在雞體內不能合成維生素A，本試驗中未發現角黃素發生降解的現象，提示角黃素在雞體內的消除可能大部分是通過排泄方式完成的，這與文獻報道的角黃素經口服后在動物體內只有3% ～8%被吸收、糞便排泄是主要的消除途徑(比如猴子中85%～89%的角黃素經糞便排出體外)的研究結果［15］相一致。

CLB是指體內諸消除器官在單位時間內消除藥物的血漿容積，是肝臟、腎臟、肺臟以及其他消除途徑消除率的總和，與動力學模型無關。在描述藥物消除中，CLB考慮到表觀分布容積和消除半衰期兩者的變化，是一個比消除半衰期更有用的藥物消除測量指數［16－18］。本試驗中角黃素在雞體內的CLB為0.905 L/(kg·h)，而虹鱒魚中角黃素的CLB為0.0173 L/(kg·h)，說明角黃素在雞體中的總體清除速率要高于虹鱒魚。但由圖1可知，角黃素經口服灌胃后，在10～24 h，血清中角黃素濃度迅速減少，而24 h后其濃度在血清中清除非常緩慢，基本維持穩定。綜合分析，角黃素在雞體內的消除速度較慢。

Vd值是指體內藥物總量待平衡后，按測得的血漿藥物濃度計算時所需的體液總體積。它的大小可以反映藥物分布的廣泛程度。如果藥物在體內均勻分布，當Vd值大于1.0 L/kg時，則藥物的組織濃度高于血漿濃度，藥物在體內分布廣泛，或者組織蛋白對藥物有高度結合［10，17］。本試驗中經口服給予雞角黃素后發現，Vd值(2.515 L/kg)約高于虹鱒魚中Vd值的12倍，這一結果提示了角黃素在雞體內分布可能非常廣泛。Tyczkowski等［19］的報道也驗證了這一推論，他們研究發現角黃素經口服給予雞后能夠在空腸、大腸、血清、肝臟、腳趾、肌肉、脂肪、皮膚、卵巢等組織器官中檢出。

AUC與吸收后體循環的藥量成正比例，它反映進入體循環藥物的相對量，是計算生物利用度的 基 礎 數 值［10］。 本 試 驗 中 AUC 為10.607μg/(mL·h)，明 顯 低 于 虹 鱒 魚 中 的52.9μg/(mL·h)，但由于給藥劑量、劑型等因素不同，所以還不能說明雞體中角黃素的吸收率一定低于虹鱒魚。要比較角黃素在不同動物體內的吸收率還需要計算經靜脈注射后角黃素的AUC值，從而求出生物利用率進行比較。

4 結論

加麗素紅經雞口服后，角黃素在雞體內的代謝過程符合一級吸收一室模型，且具有吸收迅速、較快達到峰濃度、在組織器官中分布廣泛、體內消除速度較慢等特點。

［1］ 張克英，陳代文，袁中彪.加麗素黃與加麗素紅對肉雞腳脛和胴體著色程度的影響［J］.飼料博覽，2000，(1):6 －8.

［2］ 張院萍.紅心蛋到底好不好［J］.中國牧業通訊，2005(13):86－87.

［3］ 楊振海.飼料著色劑已成為必需的飼料添加劑［J］.中國飼料，2004(7):4－6.

［4］ 汪洪濤，徐學明，金征宇.角黃素的性質與開發應用［J］.糧食與飼料工業，2003(6):31 －32.

［5］ BAKE R T M.Canthaxanthin in aquafeed applications:is there any risk?［J］.Trends in Food Science and Technology，2001，12(7):240 －243.

［6］ 張華，楊鑫，馬鶯，等.飼料中角黃素的高效液相色譜法測定［J］.分析測試學報，2008，27(7):785－787.

［7］ NIERENBERG D W.Determination of serum and plasma concentrations of retinol using high performance liquid chromatography［J］.Journal of Chromatography，1984，311(2):239 －248.

［8］ SAPUNTZAKIS M，BOWEN P E，KIKENDALL J W，et al.Simultaneous determination of serum retinoland various carotenoids:their distribution in middleaged men and women［J］.Journal of Micronutrient A-nalysis，1987，3:27 －45.

［9］ GOBANTESI，CHOUBERT T G，LAURENTIE M，et al.Astaxanthin and canthaxanthin kinetics after ingestion of individual doses by immature rainbow trout oncorhynchus mykiss［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1997，45(2):454 －458.

［10］ 王廣基.藥物代謝動力學［M］.北京:化學工業出版社，2005:95－97.

［11］ BIERER T L，MERCHEN N R，ERDMAN JW.Comparative absorption and transport of five common carotenoids in preruminant calves［J］.The Journal of Nutrition，1995，125(6):1569 －1577.

［12］ GARTNER C，STAHL W，SIES H.Preferential increase in chylomicron levels of xanthophylls lutein and zeaxanthin compared to beta-carotene in the human［J］.International Journal for Vitamin and Nutrition Research，1996，66(2):119 －125.

［13］ KOSTIC D，WHITE W S，OLSON J A.Intestinal absorption，serum clearance and interactions between lutein andβ-carotenewhen administered to human adults in separate or combined oral doses［J］.The American Journal of Clinical Nutrition，1995，62:604 －610.

［14］ CHOUBERT G，CRAVEDI J P，LAURENTIE M.Pharmacokinetics and bioavailabilities of 14C-keto-carotenoids，astaxanthin and canthaxanthin，in rainbow trout，Oncorhynchus mykiss［J］.Aquaculture Re-search，2005，36(15):1526 －1534.

［15］ EFSA Panel on Food Additives and Nutrient Sources Added to Food(ANS).Scientific opinion on the re-evaluation of canthaxanthin as a food additive［J］.EFSA Journal，2010，8(10):1852 － 1894.

［16］ 梁文權.生物藥劑學與藥物動力學［M］.北京:人民衛生出版社，2007:12－23.

［17］ 夏蓋爾，吳幼玲，余炳灼.應用生物藥劑學與藥物動力學［M］.北京:化學工業出版社，2006:35－78.

［18］ 蘇成業，韓國柱.臨床藥物代謝動力學［M］.北京:科學出版社，2003:30－35.

［19］ TYCZKOWSKI J K，HAMILTON P B.Absorption，transport and deposition in chicken of lutein diester，a carotenoid extracted from marigold petals［J］.Poultry Science，1986，65:1526－1531.