二次回歸正交旋轉組合設計優化21～42日齡肉仔雞膽堿和蛋氨酸需要量

王斯佳 蔡輝益 劉國華 閆海潔 廖瑞波 鄧會玲 湯建平

(中國農業科學院飼料研究所，家禽營養與飼料研究室，北京 100081)

膽堿是維持動物體正常生理功能和代謝活性的必需營養物質，在構成細胞結構和調節脂肪代謝中發揮著重要作用。膽堿缺乏通常表現為生長受阻、飼料利用率下降、腿部疾病增多、脂肪代謝能力低下及腎臟出血等。蛋氨酸是動物的必需氨基酸，它在機體內直接或間接參與甲基化過程、體蛋白質合成、谷胱甘肽等生物活性物質的合成。家禽蛋氨酸缺乏將造成體內蛋白質合成受阻，表現為發育不良、肌肉萎縮、生長減慢、羽毛變質、肝腎機能損壞、膽堿或維生素B12缺乏癥加劇。膽堿的需要量受飼糧、日齡等因素，特別是飼糧中甲基供體物質含量的影響，因此，膽堿需要量的研究多數都是圍繞膽堿與其他營養物質的相互關系進行的［1］。膽堿和蛋氨酸都是重要的甲基供體，二者通過甜菜堿實現了甲基的循環傳遞。膽堿在細胞線粒體內轉化為甜菜堿，甜菜堿可將甲基轉移給高半胱氨酸合成蛋氨酸，蛋氨酸經活化為S－腺苷蛋氨酸形式為機體提供活性甲基，代謝后的蛋氨酸又生成高半胱氨酸進入甲基循環之中。一般認為，動物機體對蛋氨酸和膽堿本身的需要量一旦滿足，對活性甲基的需要可通過膽堿或蛋氨酸來提供，即膽堿能節約正常用于甲基轉移的蛋氨酸［2］。由此可見，試驗飼糧中膽堿水平的差異，將會影響蛋氨酸的需要量。因此，對兩者需要量的研究也不可孤立開來。然而，目前所使用的膽堿和蛋氨酸營養標準是基于幾十年前的研究結果，并且是以純合飼糧的結果外推得出，已無法滿足當前集約化飼養下肉仔雞的快速生長的需要。本試驗通過兩因子二次回歸正交旋轉組合設計，以飼糧中膽堿和蛋氨酸水平為自變量，以21～42日齡肉仔雞生長性能和屠宰性能的部分指標為因變量，旨在研究膽堿和蛋氨酸需要量的理想組合。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

采用兩因子二次回歸正交旋轉組合設計，建立以膽堿和蛋氨酸水平為自變量，關于肉仔雞生長性能和屠宰性能的函數，以獲得21～42日齡肉仔雞膽堿和蛋氨酸最佳需要量的參數，并對各因素如何影響各響應目標值進行分析，具體編碼情況見表1。根據設計要求，本試驗共分為12個組，1～8組為試驗組，9～12組為中心組。以NRC(1994)提供的21～42日齡肉仔雞膽堿和蛋氨酸的需要量為中心點，各組試驗飼糧膽堿和蛋氨酸水平見表2。膽堿和蛋氨酸分別以DL－蛋氨酸(純度≥99%)和氯化膽堿(純度≥50%)的形式添加，蛋氨酸購自住友化學公司(日本)，氯化膽堿購自滄州偉業飼料科技有限公司。

表1 因素水平編碼表Table 1 Coding table of factors and levels

1.2 試驗動物及飼養管理

購入同期出雛的1日齡愛拔益加(AA)肉仔雞580只。1～21日齡期間統一飼喂由前期試驗［3］所得出的滿足1～21日齡肉仔雞最佳生長性能的膽堿和蛋氨酸水平的飼糧，膽堿和蛋氨酸水平分別為 1 500 mg/kg和 0.47%，代謝能為12.46 MJ/kg，粗蛋白質為 20.02%。21日齡時，肉仔雞空腹12 h后稱重，根據體重選出480只試雞，隨機分為12個組，每組4個重復，每個重復10只雞，公母各占1/2，各組試雞初始重差異不顯著(P＞0.05)。常規飼養免疫程序。試驗期為21 d。試驗期間試雞自由采食、飲水。

1.3 基礎飼糧

本試驗采用膽堿和蛋氨酸含量較低的原料配制玉米－豆粕型基礎飼糧，除膽堿和蛋氨酸水平外，其他營養水平參照NRC(1994)21～42日齡肉仔雞營養需要量。基礎飼糧組成及營養水平見表3。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 生長性能指標

平均日增重:分別在試驗的第1天和第21天，以重復為單位對空腹12 h后的肉仔雞進行稱重，并計算每只試雞平均日增重。

平均日采食量:統計試驗全期每個重復的耗料量，對死淘雞進行校正后，計算每只雞平均日采食量。

表2 試驗飼糧膽堿和蛋氨酸水平Table 2 The levels of choline and methionine in experimental diets

表3 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)Table 3 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

料重比:用每只雞平均日采食量除以每只雞的平均日增重，計算出每只雞的料重比。

1.4.2 屠宰性能指標

試驗結束時，每個重復選取接近平均體重的2只試雞(1公1母)，稱活重，經頸靜脈放血致死。

屠宰率:去毛、腳角質層、趾殼及喙殼后的重量即為屠體重。

屠宰率(%)=100×屠體重/宰前活重。

全凈膛重:屠體重去氣管、食道、嗉囊、腸道、脾臟、胰臟、膽囊、生殖器官、心臟、肝臟、腺胃、肌胃、肺臟、腹脂和頭腳的重量。肝臟密封后－20℃保存備用。

胸肌率:由胸骨剝離右側胸肌并稱重即為胸肌重。胸肌密封后－20℃保存備用。

胸肌率(%)=100×2×(右側胸肌重/全凈膛重)。

腿肌率:取右側腿，去骨、皮膚及皮下脂肪后稱重即為腿肌重。腿肌密封后－20℃保存備用。腿肌率(%)=100×2×(右側腿肌重/全凈膛重)。

腹脂率:將腹腔脂肪及肌胃周圍脂肪剝離后稱重即為腹脂重。

1.4.3 血脂指標

試驗結束時，每個重復選取接近平均體重的2只試雞(1公1母)，心臟采血，血液經離心后取血清，由中國解放軍第三零九醫院采用日立H7600－020全自動生化分析儀測定總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)含量。

1.4.4 組織中脂肪含量的測定

將待測組織經冷凍干燥機(FD－1B－50，北京博醫康公司)冷凍干燥72 h，回潮后粉碎制成干樣。稱取干樣1.5 g左右，用索氏提取法測定胸肌、腿肌和肝臟的粗脂肪含量。

1.4.5 肉品質指標

肌肉pH:于左側胸肌相同位置取寬度和厚度約為3 cm的肉樣，在屠宰45 min后，按pH計使用說明，將電極直接插入肉樣，插入深度約為1 cm，測定pH45min，而后將肉樣保存在4℃的冰箱中，24 h后用同樣方法測定pH24h。

滴水損失:于左側胸肌中部相同位置，順肌纖維方向取1 cm×1 cm×2 cm的肉樣，置于感應量為0.01 g的天平上稱重，記為W1。用棉線將肉樣系于封閉的塑料瓶中，避免肉樣與瓶壁接觸，4℃貯存24 h后稱重，記為W2。

滴水損失率(%)=100×［(W1－W2)/W1］。

1.5 數據處理與統計分析

試驗數據采用SPSS 16.0統計分析軟件中GLM程序進行方差分析，經F檢驗差異顯著后，用Duncan氏法進行多重比較。所有數據均以“平均值±標準誤”表示。應用Design Expert 8.0軟件中的Central Composite對生長性能和屠宰性能各指標進行多元非線性回歸分析，Statistics 7.0繪制3D響應面圖。

2 結果

2.1 不同膽堿和蛋氨酸水平對肉仔雞生長性能的影響

如表4所示，不同組間的平均日增重、平均日采食量和料重比的差異不顯著(P＞0.05)。但中心組的平均日增重和平均日采食量較其他組高，料重比較低。通過采用協方差分析方法進行統計，各組試雞的初始重對平均日增重、平均日采食量及料重比的回歸關系影響不顯著(P＞0.05)，無需進行校正。

2.2 不同膽堿和蛋氨酸水平對肉仔雞屠宰性能的影響

如表5所示，第2組的屠宰率顯著高于第3、7組(P＜0.05)。第5組的腹脂率顯著低于第3、4、8組(P＜0.05)，并極顯著低于第 6組(P＜0.01)。但不同膽堿和蛋氨酸水平對21～42日齡肉仔雞的胸肌率和腿肌率影響不顯著(P＞0.05)。

2.3 不同膽堿和蛋氨酸水平對肉仔雞血脂的影響

如表6所示，第9、12組血清的甘油三酯含量顯著低于第6組(P＜0.05);第5組的血清低密度脂蛋白含量顯著低于第8組(P＜0.05);但不同組間血清總膽固醇和高密度脂蛋白含量無顯著差異(P ＞0.05)。

2.4 不同膽堿和蛋氨酸水平對肉仔雞體脂沉積的影響

如表7所示，不同膽堿與蛋氨酸水平對肉仔雞體脂沉積的影響顯著(P＜0.05)。第1組的腿肌肌脂率顯著高于第3組和中心組(P＜0.05);第1組胸肌肌脂率顯著高于第8組(P＜0.05)，并極顯著高于第3組(P＜0.01);第2組的肝脂率顯著低于第8組(P＜0.05)且極顯著低于第4組(P＜0.01)。

2.5 不同膽堿和蛋氨酸水平對肉仔雞胸肌品質的影響

如表8所示，第3、5組45 min的初始pH顯著高于第1、2和6組(P＜0.05)，第5組24 h的終末pH顯著高于第9組(P＜0.05)，第1和6組45 min～24 h的△pH顯著低于第3、8、9組(P＜0.05);第5組的滴水損失率顯著低于第8組(P＜0.05)并極顯著低于第7組(P ＜0.01)。

表4 膽堿和蛋氨酸水平對肉仔雞生長性能的影響Table 4 Effects of dietary choline and methionine level on growth performance in broilers

表5 膽堿和蛋氨酸水平對肉仔雞屠宰性能的影響Table 5 Effects of dietary choline and methionine level on slaughter performance in broilers %

2.6 回歸分析

根據二次回歸正交旋轉組合試驗設計要求，以膽堿和蛋氨酸為自變量，以生長性能和屠宰性能的各指標為因變量，利用Design Expert 8.0軟件，建立二元二次回歸方程:

并用Statistics 7.0軟件繪制相應的3D響應面圖，對其顯著性進行分析并試圖找出飼糧中膽堿和蛋氨酸的最佳需要量，見表9、表10。對回歸方程的顯著性進行評價，平均日采食量、料重比、腹脂率和肝脂率的方程擬合良好。

表6 膽堿和蛋氨酸水平對肉仔雞血脂的影響Table 6 Effects of dietary choline and methionine level on blood lipids in broilers mmol/L

表7 膽堿和蛋氨酸水平對體脂沉積的影響Table 7 Effects of dietary choline and methionine level on body fat deposition in broilers %

表8 膽堿和蛋氨酸水平對肉仔雞胸肌品質的影響Table8 Effects of dietary choline and methionine level on quality of breast muscle in broilers

表9 不同膽堿和蛋氨酸水平下肉仔雞生長性能的回歸分析Table 9 Regression analysis of growth performance based on different levels of choline and methionine in broilers

表10 不同膽堿和蛋氨酸水平下肉仔雞屠宰性能的回歸分析Table 10 Regression analysis of slaughter performance based on different levels of choline and methionine in broilers

如圖1所示，X1和X2軸分別代表了膽堿和蛋氨酸的水平編碼值，Y軸代表肉仔雞的平均日采食量。曲面上各坐標點代表了不同膽堿和蛋氨酸水平組合下肉仔雞的平均日采食量，高曲面代表平均日采食量較高，反之表示較低。由曲面得知，當膽堿水平編碼值在－0.500～0.500時，平均日采食量隨著蛋氨酸水平的增加而上升，但蛋氨酸增加至0編碼水平后，繼續增加對平均日采食量的影響效果不明顯;當膽堿水平編碼值在－1.414～－0.500或0.500 ～1.414 時，平均日采食量均會隨著膽堿編碼值距中心距離的增大而下降。

圖1 膽堿和蛋氨酸對肉仔雞平均日采食量影響的響應面圖Fig.1 Response surface graph of the effects of choline and methionine on ADFI in broilers

如圖2所示，蛋氨酸水平編碼值在－0.300～0.300，膽堿水平編碼值在 －0.500 ～0.500 時，21～42日齡肉仔雞的料重比降至最低;料重比隨著膽堿和蛋氨酸距中心區域的遠離程度逐漸升高。由此可見，膽堿和蛋氨酸水平過高或過低，都會對肉仔雞的平均日采食量和料重比產生不利影響，從而妨礙生長性能的發揮。

圖2 膽堿和蛋氨酸對肉仔雞料重比影響的響應面圖Fig.2 Response surface graph of the effects of choline and methionine on F/G in broilers

如圖3所示，當蛋氨酸水平編碼值在－1.414～ －1.000時，腹脂率隨著膽堿水平的增加而下降，但膽堿和蛋氨酸二者水平同時較低，或蛋氨酸水平過高時，會加劇腹脂的沉積。

圖3 膽堿和蛋氨酸對肉仔雞腹脂率影響的響應面圖Fig.3 Response surface graph of the effects of choline and methionine on abdominal fat percentage in broilers

如圖4所示，膽堿水平較高且蛋氨酸水平較低時，有利于肝脂率的降低;而在低膽堿、高蛋氨酸水平下，肝脂率有下降趨勢;兩者編碼值同時取－1.414時，肝脂率最高;兩者編碼值同時取1.414時，肝脂率有上升的趨勢。因此，我們認為，高膽堿、低蛋氨酸飼糧可有效降低肉仔雞的腹脂率和肝脂率。二者同時過量或缺乏，都不利于脂肪的出肝轉運。

圖4 膽堿和蛋氨酸對肉仔雞肝脂率影響的響應面圖Fig.4 Response surface graph of the effects of choline and methionine on liver fat percentage in broilers

經優化分析，在本試驗條件下，當飼糧膽堿和蛋氨酸水平分別為1 030 mg/kg和0.43%時，肉仔雞可達最大平均日采食量;當膽堿水平為990 mg/kg，蛋氨酸水平為0.40%時，料重比降至最低;膽堿和蛋氨酸水平分別為1 880 mg/kg和0.37%時，肉仔雞腹脂率最低;膽堿和蛋氨酸水平分別為1 780 mg/kg和0.38%時，肝脂率最低。

3 討論

3.1 家禽生產中膽堿和蛋氨酸的需要量研究

肉仔雞對膽堿需要量的確定，一般以肝臟脂肪含量、生長性能等作為評定標準。陳承禎［2］用玉米－豆粕型基礎飼糧飼喂肉仔雞，以日增重、肝脂和血脂為標準，認為21～42日齡艾維茵肉仔雞膽堿需要量為1 366 mg/kg;許麗［4］采用玉米－大豆分離蛋白－葡萄糖半純合飼糧飼喂AA肉仔雞時，以最大生長和飼料報酬為標準，認為3～4周齡肉仔雞的膽堿和蛋氨酸需要量為1 000 mg/kg。由此可見，肉仔雞對膽堿的需要量因基礎飼糧、動物品種、評定標準等的不同而存在差異。本試驗中，以玉米－豆粕型基礎飼糧飼喂肉仔雞后，發現滿足其最高平均日采食量、最低料重比的膽堿需要量為990～1 030 mg/kg;滿足肉仔雞最低腹脂率和肝脂率的膽堿需要量為1 780～1 880 mg/kg。可以看出，在生產中要達到減少脂肪沉積的目的，機體需要比保證生長更多的膽堿。美國NRC(1994)4～6周齡肉仔雞膽堿的推薦量為1 000 mg/kg，與本試驗中達到最佳生長性能的肉仔雞膽堿需要量基本一致，但遠低于本試驗中滿足最低腹脂率和肝脂率時的膽堿需要量。究其原因:首先，現代肉仔雞育種中對生長速率的過分追求，使得肉仔雞的生長速度不斷提高，對營養物質的需求量也大大增加;其次，原料中天然膽堿的含量和利用率差異很大，基礎飼糧中原料選擇和配比影響了膽堿需要量的確定。

禽類蛋氨酸的研究方法多采用劑量反應法，即根據蛋氨酸水平與生長性能間的關系，確定蛋氨酸的需要量。肉仔雞的蛋氨酸需要量依衡量指標的不同而異。本試驗中，滿足肉仔雞最高飼料利用率的蛋氨酸需要量為0.40%，低于滿足其最高平均日采食量的需要量0.43%，但高于最低腹脂率和肝脂率的蛋氨酸需要量0.38%。戴洪偉［5］以料重比和腹脂率為衡量指標，用二次多項式函數模型得出的蛋氨酸需要量分別為0.400%和0.432%，他認為滿足最低腹脂沉積的蛋氨酸需要量應比滿足最佳料重比時的高，這與本試驗的結果有出入。首先，這可能與不同原料中總含硫氨基酸的含量及其消化率間的差異有關;其次，本試驗中含有大量的膽堿，膽堿對降低脂肪沉積效果顯著，試驗中滿足最低腹脂率的蛋氨酸需要量較低，可能是膽堿替代部分蛋氨酸的結果。

3.2 膽堿和蛋氨酸對肉仔雞胴體品質的影響

本研究發現，膽堿和蛋氨酸對21～42日齡肉仔雞的屠宰率、腹脂率、肝脂率和肌脂率等都有顯著影響。前人對脂肪指標之間的相關性研究并不鮮見，但由于試驗動物的品種、日齡等的差異，結果也不盡相同。在本研究中，二者對各脂肪指標的影響無明顯規律，但總體表現為，高水平膽堿有利于降低腹脂和肝脂。顧志良等［6］研究指出，雞的腹脂率與肝脂率呈顯著正相關，并認為這是由于雞的脂肪組織本身不能合成脂肪酸，肝臟合成的脂肪酸轉運至腹部沉積的緣故。此結果也在血清中甘油三酯和低密度脂蛋白含量上得到了印證。在人上的研究認為，高水平的甘油三酯和低密度脂蛋白更易于脂肪肝的發生［7］;但本試驗還發現，膽堿和蛋氨酸在降低肝脂的同時，還增加了肌內脂肪含量。本結果與劉邵揚等［8］腹脂與肌內脂肪沉積一致的結論不符，這可能與膽堿和蛋氨酸影響脂肪的沉積的同時促進蛋白質的合成有關。膽堿和蛋氨酸都是動物體內重要的甲基供體，肉堿、肌酸等重要甲基化產物的合成都需要甲基的參與。甲基的降脂作用主要是通過抑制脂肪合成加速脂肪分解來實現的。一方面，肉堿是長鏈脂肪酸進入肌肉線粒體進行β－氧化的必需載體。膽堿和蛋氨酸通過增強肉堿的合成，加強肉堿向肌肉中的轉運，并與長鏈脂肪酸形成酸不溶肉堿進入肌肉線粒體進行β－氧化，從而抑制了脂肪的形成，減少體脂沉積，并適量提高肌肉中粗脂肪含量［9］。另一方面，膽堿作為卵磷脂的成分，可促進脂肪酸以脂蛋白的形式被運送出肝臟，防止脂肪在肝臟中過多地積累，從而起到加速脂肪分解，減少脂肪在機體中的沉積;也有人認為，膽堿缺乏造成的脂肪沉積與維生素A代謝受阻有關［10］。維生素A能有效降低過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)基因的表達量，間接抑制PPARγ調控的脂肪代謝相關基因，如乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、激素敏感酯酶(HSL)等基因的表達，最終抑制脂肪細胞的分化與成熟;也可能維生素A具有直接抑制ACC、HSL基因表達的作用，進而改變脂肪酸代謝的平衡，減少肌內脂肪沉積［11］。此外，膽堿不僅節約了用作甲基供體的蛋氨酸量，提供的甲基還增加了高半胱氨酸轉化為蛋氨酸的循環次數，使更多的蛋氨酸進入了蛋白質的合成當中［12］。

肌內脂肪是影響肉品質的重要因素，對肉的風味、嫩度、多汁性等有顯著影響［13］。本研究發現，膽堿和蛋氨酸對42日齡肉仔雞胸肌的pH和滴水損失率影響顯著，膽堿可提高胸肌24 h的終末pH，并減少胸肌的滴水損失率，蛋氨酸含量過低或過高都不利于胸肌肌肉的持水性。膽堿和蛋氨酸對肉質的改善主要通過增加肌內脂肪含量和提高抗氧化能力發揮作用。肌肉中脂類的氧化是肉質下降的主要因素，脂類氧化不僅可導致酸敗，而且可使多不飽和脂肪酸、脂溶性維生素的含量下降，大大降低肉品質。高酸度的肌肉也會導致蛋白質變性，失去持水能力。膽堿和蛋氨酸作為甲基供體，促進了脂肪酸的β－氧化，加強了體脂的脂肪動員，使肌間脂肪含量升高。通常，在一定范圍內，肌肉脂肪含量越高，保水性越強。磷脂酰膽堿(PC)是膽堿在動物體內的主要形式，PC可維持血液中超氧化物歧化酶活性，減少丙二醛含量;蛋氨酸是合成谷胱甘肽(GSH)重要的前體物質，PC與GSH共同作用，可有效防止肉中脂肪的酸敗。然而，因蛋氨酸過量造成同型半胱氨酸的堆積，將對肉品質產生不利影響。同型半胱氨酸(Hcy)有較強的促脂質過氧化的效應，但也有人認為Hcy可特異性的抑制谷胱甘肽過氧化物酶，削弱機體抗氧化保護機制，使氧化損傷突現［14］。因此，Pamplona等［15］認為，適當降低蛋氨酸水平，通過減少蛋白質氧化損傷的敏感度和線粒體中的活性氧，有助于機體抵抗氧化應激。

4 結論

①本研究發現，適量的膽堿和蛋氨酸水平可有效改善21～42日齡肉仔雞的平均日采食量、料重比、腹脂率和肝脂率。

②滿足21～42日齡肉仔雞最佳生長性能的膽堿和蛋氨酸的最佳水平分別為990～1 030 mg/kg和 0.40% ～0.43%;當膽堿和蛋氨酸水平分別為1 780～1 880 mg/kg和0.38%時，可使其肝脂和腹脂含量降至理想水平。

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