紅曲多糖的過氧化氫法脫色工藝研究*

汪鵬榮， 陳文靜， 韋 鳳， 董夏夢， 蔣冬花

(浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華 321004)

紅曲霉是一類十分重要的藥用真菌，系中藥紅曲的基原菌［1］，是一類小型絲狀腐生真菌，屬子囊菌亞門(Ascomycotina)不整囊菌綱(Plectomycetes)散囊菌目(Eurotiales)紅曲科(Monascaceae)．由于紅曲霉在發酵過程中能產生多種具有生理活性的代謝產物，如紅曲色素、Monacolin類物質、紅曲多糖、γ-氨基丁酸及多種酶類，因此紅曲霉的次級代謝產物也成為研究的焦點．紅曲多糖是從紅曲霉發酵液和菌絲體中分離出來的一種活性多糖，具有廣泛的生物學作用，如抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、提高免疫力等多種功能［2-5］．紅曲粗多糖呈黃褐色，顏色較深，對后續的分離純化及生物活性的研究有較大的影響．因此，對紅曲粗多糖進行脫色，既可以提高多糖的純度，又有利于對紅曲多糖活性的研究．

響應面分析法(Response Surface Method，RSM)是由Box等于20世紀50年代提出的一種優化工藝條件的有效方法［6］．它以回歸方程作為函數估算的工具，確定各因素及其交互作用對響應指標的影響，精確地表述因素和響應值之間的關系．響應面法已經在諸多工藝過程優化中得到應用［7］．本研究以過氧化氫為脫色劑，在單因素實驗的基礎上，采用響應面分析法對紅曲多糖的過氧化氫脫色工藝進行了優化．

1 材料與方法

1．1 材料

紅色紅曲霉(Monascus rubber)菌株Mr-70由本實驗室自行分離得到．

1．2 培養基

1)種子培養基

參見文獻［8］．組成:葡萄糖50 g，蛋白胨5 g，酵母膏 1 g，KH2PO41 g，FeSO4·7H2O 0．01 g，MgSO4·7H2O 0．5 g，水 1 000 mL，pH 6．0．

2)發酵培養基

參見文獻［9］．蔗糖40 g/L，酵母粉4．5 g/L，KH2PO4·3H2O 3．5 g/L，MgSO4·7H2O 0．4 g/L，發酵液起始pH 5．0．

1．3 儀器設備與試劑

C24KC生物恒溫搖床(美國Certified公司);MIKRO-22R高速冷凍離心機(德國Hettichi公司);UV-7504紫外可見分光光度計(上海欣茂儀器公司);DHG-9101．28A電熱恒溫鼓風干燥箱(山東鄄城科源儀器設備廠);HH-4數顯恒溫水浴鍋(山東鄄城科源儀器設備廠);JA3003A天平(上海精天電子儀器有限公司)．

過氧化氫(3%)和無水乙醇均為國產分析純．實驗用水為去離子水．

1．4 紅曲粗多糖的提取

用打孔器(直徑0．8 cm)取30℃培養5 d的紅曲霉菌株Mr-70接種到種子培養基中，在30℃培養48 h，再接種到液體發酵培養基中，以200 r/min，30℃培養96 h．發酵液抽濾，向濾液中加入4倍體積的無水乙醇，在5℃靜置12 h后離心，沉淀用乙醇和丙酮反復沖洗多次，在80℃烘干12 h至恒重，即得紅曲霉胞外粗多糖．

1．5 脫色率測定

對紅曲粗多糖溶液進行可見-紫外光全波長掃描，結果表明無色素的最大吸收波長．根據互補色原理，選擇450 nm為檢測波長［10］，并按照公式(1)計算脫色率:

1．6 單因素實驗

選取過氧化氫加入量、脫色溫度和脫色時間3個影響因素，分別做單因素實驗．具體做法如下:取20 mL的試管，分別加入4 mL紅曲粗多糖提取液，按設計要求加入適量的過氧化氫，在設定的溫度下震蕩脫色相應時間，測定脫色前后的吸光度A450，按公式(1)計算各自的脫色率．

1．7 響應面優化設計實驗

根據單因素實驗結果，選擇確定過氧化氫加入量、脫色時間和脫色溫度的3個水平，按Box-Behnken方法設計3因素3水平的實驗，并利用響應面法對紅曲多糖的過氧化氫脫色條件進行優化．實驗設計方案如表1所示．

表1 Box-Behnken中心組合實驗設計因素和水平

2 結果與分析

2．1 過氧化氫加入量對脫色效果的影響

用過氧化氫法脫除紅曲多糖溶液的色素時，4 mL多糖(8 mg/mL)溶液中分別加入1，2，3，4 和5 mL 3%過氧化氫溶液，50℃水浴條件下脫色120 min，過氧化氫的加入量與脫色效果的關系如圖1所示．

圖1 3%過氧化氫溶液加入量對脫色率的影響

由圖1可知，隨著過氧化氫加入量的增加，紅曲多糖的脫色率逐漸提高．但是，當過氧化氫加入量超過4 mL后，脫色率增加很緩慢．過氧化氫加入量從1 mL增加到3 mL時，脫色率增加了6．92%;從3 mL增加到4 mL時，脫色率增加了3．16%;而從4 mL增加到5 mL時，脫色率僅僅增加了0．59%．考慮到成本和降解等因素，選擇3%過氧化氫溶液的適宜加入量為4 mL．

2．2 脫色時間對脫色效果的影響

用過氧化氫脫除紅曲多糖溶液的色素時，4 mL多糖(8 mg/mL)溶液中加入4 mL 3%過氧化氫溶液，50℃水浴條件下設定脫色時間分別為30，60，90，120 和 150 min，脫色時間與脫色效果的關系如圖2所示．

由圖2可知，隨著脫色時間的增加，脫色率也隨之增加，但當脫色時間超過120 min后，脫色率增加很緩慢．考慮到隨著脫色時間的增加多糖的損失也會增加，選定120 min為最佳脫色時間．

2．3 脫色溫度對脫色效果的影響

用過氧化氫脫除紅曲多糖溶液的色素時，4 mL多糖(8 mg/mL)溶液中加入4 mL 3%過氧化氫溶液，分別在30，40，50，60和70℃水浴條件下脫色120 min，脫色溫度與脫色效果的關系如圖3所示．

由圖3可知:溫度對紅曲多糖脫色率的影響較大，從30℃到40℃，脫色率增加了7．46%;從40℃到60℃，脫色率分別增加了18．67%和9．07%;而從60℃到70℃，脫色率僅僅增加了1．86%，同時，高溫還容易使多糖降解．因此，選擇60℃為本研究的最適脫色溫度．

2．4 響應面法優化紅曲多糖過氧化氫脫色工藝

在單因素實驗結果的基礎上，以過氧化氫加入量、脫色時間和脫色溫度3個因素為自變量、紅曲多糖脫色率為響應值，采用響應面分析法在3因素3水平上對紅曲多糖的脫色工藝進行優化．實驗因素與水平設計見表1;響應面實驗方案及結果見表2．

2．4．1 Box-Benhnken 實驗設計與分析

Box-Behnken設計每個因素取3個水平，以(-1，0，+1)編碼，對數據進行二次回歸擬合，得到包括一次項、平方項和交互項的二次方程，分析各因素的主效應和交互效應，最后在一定水平范圍內求取最佳值［11］．表2中，12組實驗為析因實驗、3組為中心實驗．15個實驗點分為析因點和零點，其中:析因點為自變量取值在X1，X2和X3所構成的三維頂點;零點為區域的中心點，零點實驗重復3次，用以估計實驗誤差．

2．4．2 回歸方程的建立與方差分析

利用 Design-Expert(version7，Stat-EaseInc．，MinneapolisN．USA)軟件對表2數據進行多元回歸擬合，得到了紅曲多糖脫色率(Y)對過氧化氫加入量(X1)、脫色時間(X2)和脫色溫度(X3)的二次多項式回歸模型:

表3和表4是對方程(2)的方差和回歸分析結果．由表 3和表 4可知:FModel=42．92，P=0．000 3 ＜0．01，表明二次多項式回歸模型極顯著;P失擬項=0．115 2 ＞0．05，說明模型失擬不顯著;模型的確定系數R2=0．987 2，表明模型與實驗數據有98．72%的符合度;調整后的 R2Adj=0．964 2，表明模型有很高的可信度，可以用此模型對紅曲多糖的過氧化氫法脫色進行分析和預測．其中:模型的一次項X1，X2和X3顯著，單因素對紅曲多糖脫色率的影響大小順序依次是脫色溫度﹥脫色時間﹥過氧化氫加入量;二次項X21，X22和X23顯著;交互項中X1X3和X2X3顯著，X1X2不顯著．

表3 方差分析表

表4 回歸分析表

2．4．3 紅曲多糖脫色率的響應面法分析

響應面分析的圖形是特定的響應值對應自變量構成的一個三維空間圖，可以直觀地反映出各自變量對響應值的影響［12］．根據回歸模型，利用Design-Expert軟件作出相應的響應曲面和等高線圖:過氧化氫加入量和脫色時間對紅曲多糖脫色率的影響見圖4;過氧化氫加入量和脫色溫度對紅曲多糖脫色率的影響見圖5;脫色時間和脫色溫度對紅曲多糖脫色率的影響見圖6．等高線的形狀(圓形或者橢圓形)可以反映出變量之間的相互影響是否顯著，圓形表示兩因素間交互作用不顯著，而橢圓形則顯著［13］．

由圖4可知:當脫色時間較短時，隨著過氧化氫加入量的增加，紅曲多糖脫色率先增加、后緩慢下降;而當脫色時間較長時，脫色率隨過氧化氫加入量的增加緩慢升高后開始顯著下降．因此，在脫色時間較短的情況下，過氧化氫加入量的增加有利于紅曲多糖脫色率的提高，而在脫色時間較長時則呈現相反的趨勢．

由圖5可知:當過氧化氫加入量一定時，隨著脫色溫度的升高，紅曲多糖脫色率逐漸增加，溫度達到一定值后，脫色率趨于平緩;當脫色溫度一定時，隨著過氧化氫加入量的增加，紅曲多糖脫色率呈現出下降的趨勢．

由圖6可知:當脫色溫度不變時，隨著脫色時間的延長，紅曲多糖的脫色率逐漸增加，脫色時間達到一定值后，脫色率的變化趨于平緩;當脫色時間一定時，隨著脫色溫度的升高，紅曲多糖的脫色率逐漸增加．表明欲達到較高的脫色率，提高脫色溫度可縮短脫色時間．但是，較高的脫色溫度可能會導致多糖的降解．在較低的脫色溫度下，適當延長脫色時間有利于紅曲多糖脫色率的增加．

2．4．4 紅曲多糖脫色條件優化

通過軟件分析得到紅曲多糖過氧化氫脫色法的最佳脫色條件:4 mL多糖(8 mg/mL)溶液中3%過氧化氫溶液的加入量為3．87 mL、脫色時間為126．97 min、脫色溫度為65．62℃，在此條件下紅曲多糖脫色率的理論值為87．20%．為驗證響應面分析法所得結果的可靠性，采用上述條件對紅曲多糖進行脫色，考慮到實際操作的便利，將上述工藝參數修正為:4 mL多糖(8 mg/mL)溶液中3%過氧化氫溶液加入量為3．9 mL，脫色時間為127 min，脫色溫度為65．6℃，3次平行試驗得到的實際平均脫色率為86．24%．實際實驗值與模型預測值基本一致．因此，基于響應曲面法所得的優化脫色工藝參數準確可靠，得到的紅曲多糖的脫色條件具有實際應用價值．

3 結論

綜上所述，為了探索用過氧化氫法脫除紅曲多糖顏色的適宜工藝條件，在過氧化氫加入量、脫色時間和脫色溫度3個單因素實驗的基礎上，采用3因素3水平的Box-Behnken中心組合實驗設計進行響應面法優化實驗，實驗結果經過軟件分析發現，紅曲多糖過氧化氫法脫色最適宜的條件為:4 mL多糖(8 mg/mL)溶液中3%過氧化氫溶液的加入量為3．9 mL、脫色時間為127 min、脫色溫度為65．6℃．在該條件下紅曲多糖的脫色率可達86．24%，與響應面模型預測的脫色率87．20%十分相近，驗證了響應面模型對脫色工藝優化結果預測的可靠性．

［1］Kohama Y，Matsumoto S，Mimura T，et al．Isolation and identification of hypotensive principles in red-mold rice［J］．Chem Pharm Bull，1987，35(6):2484-2489．

［2］丁紅梅．紅曲多糖抑瘤作用初步研究［J］．菌物研究，2007，5(3):171-173．

［3］蔡琴，沈彬彬，張慧，等．紅曲霉菌胞外多糖提取及抗氧化活性測定［J］．中華中醫藥學刊，2010(3):598-600．

［4］曾露燕，趙樹欣，李燚．紅曲霉抑菌成分糖肽類物質的分離純化及穩定性［J］．天津科技大學學報，2009，24(4):18-21．

［5］張建峰，昌友權，陳光，等．紅曲多糖的免疫活性研究［J］．食品科學，2008，29(2):391-393．

［6］曹新志，金征宇．響應曲面法在環糊精糖基轉移酶反應中的應用［J］．鄭州工程學院學報，2004，25(1):58-61．

［7］Chandrika L P，Fereidoon S．Optimization of extraction of phenolic compounds from wheat using response surface methodology［J］．Food Chemistry，2005，93(1):47-56．

［8］蔣冬花，后家衡，李杰，等．紅腐乳中高產γ-氨基丁酸紅曲霉菌株的篩選［J］．浙江師范大學學報:自然科學版，2007，30(4):447-452．

［9］李霞姣，夏永軍，王鐵軍，等．紅曲多糖液態發酵工藝條件的優化［J］．生物加工過程，2009，7(2):13-17．

［10］楊云，劉福勤，馮衛生，等．堿法提取大棗渣多糖及活性炭脫色的工藝研究［J］．食品與發酵工業，2004，30(7):30-32．

［11］呂國英，張作法，潘慧娟，等．響應面分析法優化香菇多糖發酵培養基［J］．菌物學報，2010，29(1):106-112．

［12］孫萍萍，王頡，孫劍鋒，等．響應面法對縊蟶粗多糖提取工藝的優化［J］．水產科學，2010，29(4):203-207．

［13］Muralidhar R V，Chirumamila R R，Marchant R，et al．A response surface approach for the comparison of lipase production by Candida cylindracea using two different carbon sources［J］．Biochemical Engineering Journal，2001，9(1):17-23．