佛手揮發油對小鼠體內B16黑色素瘤生長的影響*

邵鄰相， 高海濤， 成文召， 李 美， 徐 麗， 陳瑩瑩

(浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華 321004)

近年來關于植物揮發油的抗腫瘤作用有不少報道，如歐當歸［1］、髯花杜鵑［2］、百里香［3］、溫莪術［4］、葡萄柚［5］等植物的揮發油均能使體外培養的癌細胞凋亡，抑制癌細胞增殖;檸檬香茅［6］、巴豆［7］、薤白［8］、白術［9］等植物的揮發油也可抑制小鼠體內移植瘤的增殖．佛手(Citrus medica L．var．sarcodactylis(Noot)Swingle)是蕓香科柑橘屬植物佛手柑的果實，具有理氣化痰、健胃止嘔、舒肝健脾等作用．已有佛手揮發油抗菌、抗炎癥及體外抑制癌細胞增殖的研究［10-14］報道，但佛手揮發油對體內移植瘤作用的研究國內外鮮見報道．本實驗重點研究了佛手揮發油對小鼠移植性B16黑色素瘤生長的影響，為抗腫瘤藥物的研究開發提供依據．

1 材料和方法

1．1 實驗動物及細胞株

C57BL/6J小鼠，清潔級，購于上海斯萊克動物中心，合格證號:SCXK(滬)2007-0005．B16黑色素瘤細胞株購于中國科學院上海細胞生物研究所．

1．2 主要藥品和儀器

RPMI 1640培養基購于美國Gibcobrl公司;新生牛血清購于杭州四季青生物工程材料公司;青霉素和鏈霉素均為Sigma公司產品;環磷酰胺(CTX)購自江蘇恒瑞制藥有限公司;鄰苯三酚購自上海集團公司;三羥甲基氨基甲烷、硫代巴比妥酸均購于杭州昊天生物技術有限公司．

3K18通用臺式冷凍離心機為德國Sigma公司產品;Ultrospec 4000紫外/可見光分光光度計為英國Biochrom公司產品．

1．3 佛手揮發油的提取及其乳劑的制備

以鮮金華佛手為原料，用水蒸汽蒸餾法提取揮發油，再用無水硫酸鈉干燥，即得到佛手揮發油．將2 g佛手揮發油加入到2 g吐溫-80中，混勻，再慢慢加入生理鹽水，定容到100 mL，濾過除菌，然后用含2%吐溫-80的生理鹽水稀釋成質量分數為10，50和90 mg/kg的乳劑．

1．4 小鼠移植瘤模型的建立

將B16黑色素瘤細胞用含10%胎牛血清的1640培養基于CO2培養箱中培養，取對數生長期細胞，用無菌生理鹽水配制成1×107mL-1的單細胞懸液，在C57BL/6J小鼠右側鼠蹊部皮下接種0．2 mL該細胞懸液．取 B16黑色素瘤細胞在C57BL/6J小鼠體內穩定傳代14 d的小鼠，引頸處死，75%乙醇溶液消毒后，在無菌條件下剝離腫瘤組織，在無菌培養皿中剪碎，加適量生理鹽水研磨，200目細胞篩網過濾，制成細胞懸液．以4 g/L臺盼藍溶液染色計數，保證細胞活力大于95%，以無菌生理鹽水調細胞濃度為5×106mL-1，立即將該細胞懸液0．2 mL接種于C57BL/6J小鼠右側鼠蹊部，制成移植性荷瘤小鼠模型．

1．5 實驗動物分組及藥物處理

將雌雄荷瘤小鼠分別隨機分成5組，雌性小鼠每組10只，雄性小鼠每組9只．陰性對照組:小鼠腹腔注射0．2 mL 2%吐溫-80無菌生理鹽水，連續注射14 d．陽性對照組:小鼠腹腔注射環磷酰胺100 mg/(kg·d)，按常規藥理學的方法，僅第1天給藥．佛手揮發油低劑量組、中劑量組和高劑量組:分別按10，50和90 mg/(kg·d)劑量給小鼠腹腔注射佛手揮發油，連續注射14 d．同時設雌鼠、雄鼠正常對照組(雌性每組10只，雄性每組9只)．

1．6 抑瘤率測定

每日觀察各組小鼠的生長狀況，并記錄各組小鼠給藥期間的體質量．給藥14 d后，引頸處死小鼠，完整剝離腫瘤組織，稱質量;并取出荷瘤小鼠及正常對照組小鼠的心、肝、腎組織，稱質量后將其液氮速凍，再放入-70℃冰箱中低溫保存備用．以

計算抑瘤率．

1．7 超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量測定

鄰苯三酚自氧化法［15］測定超氧化物歧化酶(SOD)活性．MDA-TBA 比色法［16］測定丙二醛(MDA)含量．

1．8 統計方法

運用SPSS 13．0統計學軟件進行統計分析，數據統計結果用x±s表示，以 P ＜0．05作為差異有統計學意義．

2 結果

2．1 佛手揮發油對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

從圖1和圖2可以看出，藥物處理前3天腫瘤的生長速率相對較慢，之后生長速率加快，且陰性對照組小鼠移植瘤增長速率較其他組快．圖1顯示的是佛手揮發油對雌性荷瘤小鼠腫瘤生長的影響:陰性對照組和佛手揮發油90 mg/kg劑量組小鼠移植瘤的生長速率相對較快，陽性對照組小鼠的腫瘤生長速率最慢，佛手揮發油50 mg/kg劑量組小鼠移植瘤的生長速度顯著小于陰性對照組(P＜0．01)，說明50 mg/kg劑量的佛手揮發油對腫瘤有明顯的抑制作用．圖2顯示了佛手揮發油對雄性荷瘤小鼠腫瘤生長的影響:陽性對照組小鼠的腫瘤生長速率較慢，其他4組相比都無顯著差異(P ＞0．05)．

圖2 雄性荷瘤小鼠各處理組腫瘤生長曲線

圖1 雌性荷瘤小鼠各處理組腫瘤生長曲線

2．2 佛手揮發油對荷瘤小鼠黑色素實體瘤的影響

如表1所示，雌性荷瘤小鼠給藥各組實體瘤的質量均小于陰性對照組，其中:陽性對照組的瘤質量最小，與其他組相比差異均顯著(P＜0．05);佛手揮發油50 mg/kg劑量組小鼠的瘤體大小顯著小于陰性對照組(P＜0．01)，抑瘤率達47．2%．雄性荷瘤小鼠陽性對照組的瘤體最小，與其他各組相比，差異極顯著(P＜0．01);佛手揮發油各劑量組小鼠的瘤體較陰性對照組均減小，但差異無統計學意義(P＞0．05)．這說明50 mg/kg劑量的佛手揮發油對雌性荷瘤小鼠有顯著的抑瘤作用，各劑量佛手揮發油對雄性荷瘤小鼠的抑瘤作用不明顯．

表1 佛手揮發油對雌雄性荷瘤小鼠B16黑色素實體瘤的影響

2．3 佛手揮發油對荷瘤小鼠心、肝和腎中SOD活性的影響

如表2所示，50 mg/kg劑量的佛手揮發油能極顯著地提高雌性荷瘤小鼠肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)的活性(P＜0．01)，但不能提高雄性荷瘤小鼠肝臟中的超氧化物歧化酶活性;各劑量的佛手揮發油均能降低荷瘤小鼠心臟中超氧化物歧化酶的活性，且與正常對照組相比，差異均極顯著(P＜0．01);各劑量的佛手揮發油均不能提高荷瘤小鼠腎臟中超氧化物歧化酶的活性．這說明50 mg/kg劑量的佛手揮發油能提高雌性荷瘤小鼠肝臟的抗氧化能力．

表2 佛手揮發油對荷瘤小鼠心、肝和腎中SOD活性的影響 103U·g-1

2．4 佛手揮發油對荷瘤小鼠心、肝和腎中MDA含量的影響

如表3所示，與正常對照組相比，各組荷瘤小鼠心、肝、腎中的丙二醛(MDA)含量都有增加的趨勢．90 mg/kg劑量的佛手揮發油能使雌性荷瘤小鼠腎臟中的丙二醛含量增加，與正常對照組相比差異極其顯著(P＜0．01)．50 mg/kg劑量的佛手揮發油能降低雌性荷瘤小鼠臟器中的丙二醛含量，但與陰性對照組相比無顯著性差異(P＞0．05);它能使雄性荷瘤小鼠心臟和腎臟中丙二醛含量極顯著增加(P＜0．01)．這說明佛手揮發油不能降低荷瘤小鼠心、肝、腎中丙二醛的含量．

表3 佛手揮發油對荷瘤小鼠心、肝和腎中MDA含量的影響 μg·g-1

3 討論

近年來，體內外實驗研究表明，植物揮發油具有明顯的抗腫瘤活性．文獻［17］研究發現，百里香揮發油對體外培養的人卵巢癌細胞株IGR-OV1及小鼠肥大細胞癌P815實體瘤有抑制作用．張卿等［8］研究表明，薤白揮發油能顯著抑制體外培養的S180和H22細胞的增殖，對小鼠S180和H22實體瘤有顯著的抑制作用．本實驗室已研究發現，佛手揮發油能使體外培養的B16黑色素瘤細胞和MAD-MB-435癌細胞凋亡，抑制其增殖［10-11］．本實驗結果顯示，佛手揮發油能抑制小鼠B16黑色素實體瘤的生長，50 mg/kg劑量的佛手揮發油對雌性荷瘤小鼠的作用最明顯，抑瘤率達47．2%．

超氧化物歧化酶可以特異性地清除超氧陰離子自由基(O-2)，在機體的氧化和抗氧化水平上起著極其重要的作用．如果O-2等自由基不能被及時清除，它們就會攻擊生物膜脂質中的多聚不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化反應，生成丙二醛等脂質過氧化物．王海霞等［18］研究認為番茄紅素具有抑制腫瘤生長的作用，可能與提高超氧化物歧化酶活力、降低丙二醛含量及減輕DNA損傷有關．本實驗結果顯示，50 mg/kg劑量的佛手揮發油能顯著提高雌性荷瘤小鼠肝臟中的超氧化物歧化酶活性，提高了機體的抗氧化能力，從而抑制了腫瘤的生長．

佛手揮發油對C57BL/6J荷瘤小鼠的抑瘤作用及抗氧化能力存在著性別差異性．胡小靜等［19］用昆明小鼠研究了曬青綠茶和普洱茶多糖的抗氧化活性，發現青綠茶多糖和普洱茶多糖均能提高雄性小鼠的總抗氧化能力，但對雌性小鼠作用不明顯．而本實驗結果顯示，佛手揮發油能提高雌性小鼠的抑瘤率和抗氧化能力，對雄性小鼠的作用不明顯．小鼠的抗氧化能力和抗腫瘤作用存在性別差異性的原因尚不明確，還有待于進一步研究．

綜上所述，佛手揮發油具有體內抗腫瘤作用，這可能與佛手揮發油能使腫瘤細胞凋亡、提高小鼠自身的抗氧化能力有關．

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