益氣養血化瘀湯對實驗性心肌缺血大鼠心肌細胞凋亡及Bax、Bcl－2蛋白表達的影響

姜元輝，段富津，潘志

(1．黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040;2．黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

益氣養血化瘀湯是導師段富津教授在多年臨床實踐中總結出來的治療冠心病一系列有效方劑之一，該方對氣血兩虛兼血瘀型冠心病有確切的療效。本研究將觀察益氣養血化瘀湯對心肌細胞凋亡與相關蛋白表達干預的作用。闡明益氣養血化瘀湯治療心肌缺血的作用機理，為其推廣應用提供堅實的理論基礎。

1 材料與方法

1．1 動物與藥物

健康Wistar大鼠60只，體質量(250±10)g，雌雄各半，由吉林大學基礎醫學院實驗動物中心提供。合格證號為(吉)第2007－0003號。按體質量將60只健康實驗用大鼠隨機分為空白對照組(以下簡稱空白組)、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、地奧心血康陽性對照組(以下簡稱對照組)6組。每組10只，飼養1周。

益氣養血化瘀湯(由黑龍江中醫藥大學制劑室提供);地奧心血康膠囊(批號0810044，100mg/粒，成都地奧制藥公司，用時將膠囊去殼，內容物用蒸餾水配制成混懸液);鹽酸異丙腎上腺素(ISO)注射液(批號080402，1mg/2ml，上海禾豐制藥有限公司);烏拉坦(滬Q/HG22－771/68，批號 010205);Bcl－2免疫組化染色試劑盒(產品代號:SA2015)，細胞凋亡檢測試劑盒(產品代號:MK1020)，Bax免疫組化染色試劑盒(產品代號:SA1022)，以上試劑盒均由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1．2 實驗器材

普通光學顯微鏡(日本，OLYMPUS);攝影顯微鏡(CH)型(日本，OLYMPUS);LKB－V超薄切片機(瑞典)。

1．3 實驗方法

按人與大鼠體表面積換算灌胃給藥，高、中、低劑量組比例為4∶2∶1，劑量分別為高劑量組 (28．58g/kg)，中劑量組(14．29g/kg)，低劑量組(7．145g/kg)，對照組(41．49mg/kg)。大鼠每次灌胃 1．5ml/100g。模型組每天相應給以生理鹽水。與造模后開始給藥，每日2次，連續給藥7天。

按文獻方法進行心肌組織切片制備［1］，心肌細胞凋亡原位標記檢測及計算機圖像分析［2］，免疫組化法檢測 Bcl－2 與 Bax［3］。

1．4 統計學處理 采用SPSS 12．0統計軟件對上述檢查結果進行分析處理。實驗數據以均數±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0．05為差異具有顯著性差異，P＜0．01為差異具有極顯著性差異。

2 結果

2．1 心肌細胞凋亡變化

通過TUNEL法檢測了心肌細胞凋亡情況及治療組的干預作用，實驗結果顯示，光鏡下正常組大鼠未見明顯陽性反應。其他各組凋亡心肌細胞TUNEL陽性標記表現為心肌凋亡陽性細胞的細胞核為深淺不一的棕褐色，細胞輪廓清楚;而正常細胞核呈藍色，心肌細胞輪廓完整。各治療組細胞凋亡指數與模型組相比，均有極顯著差異(P＜0.01)見表1。

表1 益氣養血化瘀湯治療前后各組實驗大鼠細胞凋亡指數的比較(±s，n=10)

表1 益氣養血化瘀湯治療前后各組實驗大鼠細胞凋亡指數的比較(±s，n=10)

注:與空白組比較，▲P ＜0．01;與模型組比較，★P＜0．05，★★P ＜0.01。

AI空白組組別n 10 0．79 ±0．12模型組 10 2．44 ±0．18▲低劑量組 10 2．21 ±0．20★★中劑量組 10 1．73 ±0．16★★高劑量組 10 1．40 ±0．16★★對照組 10 1．50 ±0．18★★

表2 益氣養血化瘀湯治療前后各組實驗大鼠Bax和Bcl－2蛋白表達灰度值比較(±s，n=10)

表2 益氣養血化瘀湯治療前后各組實驗大鼠Bax和Bcl－2蛋白表達灰度值比較(±s，n=10)

注:與空白組比較，▲P ＜0．01;與模型組比較，★P＜0．05，★★P ＜0.01。

BaxBcl－2空白組組別n 10 153．4 ±5．32 190．1 ±8．95模型組 10 172．4±5．48▲ 161．3±6．18▲低劑量組 10 164．3±5．23★★ 168．3±6．34★中劑量組 10 158．7±6．57★★ 169．1±5．88★高劑量組 10 155．3±4．72★★ 182．8±10．26★★對照組 10 155．6±6．57★★ 174．2±6．66★★

2．2 急性心肌缺血大鼠心肌細胞凋亡相關基因Bcl－2、Bax表達水平

由表2可知，治療各組在Bax蛋白表達上與模型組相比，均有極顯著差異(P＜0.01);在Bcl－2蛋白表達上，益氣養血化瘀湯中、低劑量組與模型組相比，差異顯著(P＜0.05)，而高劑量組與模型組比較，差異極顯著(P＜0.01)。

3 討論

胸痹一病總以氣虛為本，血瘀為標，益氣養心活血湯具氣血雙補之功。使陽生陰長，氣血速生，同時補中寓行，行中有補，使補而不滯，藥力迅速布達周身，全方共奏益氣養血活血之功，使心有所主，神有所安，諸癥自除。

Bcl－2蛋白是一種膜整合蛋白，存在于細胞中的線粒體核膜、內質網膜上，并對抗各種凋亡的刺激而對細胞起保護作用，且主要作用在線粒體。Bcl－2蛋白家族的成員有促進和抑制凋亡的功能。Bcl－2通過與Bax結合抑制凋亡并促進細胞存活，Bcl－xs通過與Bcl－2的結合置換Bax，啟動凋亡。這一模式很可能是Bcl－2家族蛋白作用于凋亡過程的基本模式。在缺血缺氧狀態下，心肌細胞可發生凋亡。心肌細胞凋亡是缺血心肌損傷的重要機制，可導致心肌重構，引發心律失常或心力衰竭［4］。實驗結果顯示，心肌缺血模型組大鼠心肌不僅細胞凋亡發生率極高，且心肌細胞Bax蛋白表達也明顯上調，同時發現，心肌缺血模型組大鼠心肌細胞Bcl－2蛋白表達有所減弱。益氣養血化瘀湯能明顯下調凋亡刺激基因Bax的蛋白表達，上調凋亡抑制基因Bcl－2的蛋白表達，通過調節缺血心肌Bax、Bcl－2基因的蛋白表達從而抑制和阻斷細胞凋亡的發生，這也是益氣養心活血湯防治CHD(冠心病)心肌缺血損傷的分子病理機制之一。

［1］ 王大安，藺志華．血府逐瘀湯干預急性心肌缺血心肌細胞凋亡與Bcl－2、Bax表達的實驗研究［J］．中西醫結合心腦血管病雜志，2009，7(1):44－45．

［2］ 王大安，李建文．丹參飲干預急性心肌缺血心肌細胞凋亡與Bcl－2、Bax表達的實驗研究［J］．中華中醫藥學刊，2009，27(7):1513－1514．

［3］ 潘志．冠心康抗大鼠急性心肌缺血及對p53和Bcl－2的干預研究［D］．哈爾濱:黑龍江中醫藥大學，2005．

［4］ 王學穎，王階，楊戈．心梗后的心肌細胞凋亡與中醫藥干預研究進展［J］．中醫藥學報，2010，38(2):57－59．