MTT法檢測(cè)沒食子酸對(duì)兩種細(xì)胞的體外毒性

嚴(yán)曉鶯，陳巨鵬，王明艷

(1．南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210046，2．江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029)

沒食子酸(gallic acid，GA)又名五倍子酸，化學(xué)名3，4，5－三羥基苯甲酸，是一種多酚類化合物，廣泛存在于中草藥山茱萸、五倍子、芍藥［1］及植物葡萄、石榴的果皮中。GA可以抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡［2－3］，但是對(duì)正常細(xì)胞的毒性研究報(bào)道并不多見。本實(shí)驗(yàn)選用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GA對(duì)體外生長(zhǎng)的人正常肝細(xì)胞株LO2和人肝癌細(xì)胞株SMMC－7721增殖的影響，為其開發(fā)為新藥提供理論依據(jù)。

1 材料

1．1 藥品

沒食子酸(GA，分子量170，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110831－200803);順鉑(DDP，齊魯制藥有限公司，批號(hào)0070332DC)。

1．2 細(xì)胞株

人正常肝細(xì)胞株 LO2、人肝癌細(xì)胞株 SMMC－7721均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1．3 試劑

RPMI－1640培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、小牛血清(NBS)(GIBCO公司);乙二胺四乙酸(EDTA)(SOLARBIO公司);磷酸緩沖鹽(PBS)(博士德公司);溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(AMRESCO公司)。

1．4 儀器

圖像獲取系統(tǒng)(OlympusDP71);倒置顯微鏡(MoticAE31);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Bio－Rad680723);超低溫冰箱(MDF－382ECM);CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO);超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司);電熱恒溫水浴箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);電子分析天平(AY220，日本島津)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2．1 藥液的配制

精確精密稱取沒食子酸17mg，生理鹽水定容至10ml充分溶解，配成濃度為10mmol/L的儲(chǔ)存液，0.22um濾器過濾除菌，－20℃避光保存，臨用前用培養(yǎng)液稀釋至實(shí)驗(yàn)所需的終濃度。

2．2 細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇凍存的細(xì)胞，離心去除凍存液，加入含10%血清的RPMI－1640培養(yǎng)液(pH值7．2)，于37℃飽和濕度、5%CO2孵箱中靜置培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)到80%后，加入 1ml消化液(含 0．02%EDTA，0．25%胰酶)消化，待細(xì)胞變圓，間隙增大時(shí)，棄消化液，加入2ml培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打制成單細(xì)胞懸液，LO2按1/4比例傳代，SMMC－7721按1/8比例傳代，每3～4天傳1次。

2．3 MTT 檢測(cè)［4］

分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LO2細(xì)胞和SMMC－7721細(xì)胞制成密度為5×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，每孔100μl接種于96孔板中培養(yǎng)。分為陰性對(duì)照組、不同劑量加藥組和陽性對(duì)照組，每組設(shè)5個(gè)平行孔，細(xì)胞貼壁以后，棄去舊的培養(yǎng)液，更換新的培養(yǎng)液，加藥組培養(yǎng)液含有 GA，終濃度分別為 6．25、12．5、25、50、100μmol/L，陽性對(duì)照組培養(yǎng)液含有順鉑，終濃度為5μg/ml。藥物作用細(xì)胞后 24h、48h、72h，取出培養(yǎng)板，每孔加入 5mg/ml的 MTT 10μl，混勻，繼續(xù)培養(yǎng) 4h，棄去上清液，每孔加入100μl DMSO，震蕩10min使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀測(cè)每孔吸光度，波長(zhǎng)490nm。抑制率(%)=1－用藥組OD值/陰性對(duì)照組OD值×100%。

2．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 13．0進(jìn)行單因素方差分析(One way ANOVA)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

不同劑量的GA作用24h、48h、72h對(duì)體外培養(yǎng)的LO2和SMMC－7721細(xì)胞均有一定的抑制作用。

3．1 GA對(duì)LO2細(xì)胞的生長(zhǎng)的影響

6．25 、12．5、25、50、100μmol/L 劑量組與陰性對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0．05)，對(duì)LO2細(xì)胞有增殖抑制作用，且呈劑量依賴關(guān)系，25、50、100μmol/L濃度組對(duì)LO2細(xì)胞的抑制隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，呈現(xiàn)時(shí)間依賴關(guān)系(見表1)。

表1 沒食子酸作用24、48、72h對(duì)LO2細(xì)胞增殖的影響(±s)

表1 沒食子酸作用24、48、72h對(duì)LO2細(xì)胞增殖的影響(±s)

注:與陰性對(duì)照組比較，*P ＜0．05。

藥物濃度(μmol/L)與分組24h抑制率(%)48h抑制率(%)72h抑制率(%)陰性對(duì)照組0006．25 18．1 ±10．9* 17．4 ±18．5* 17．4 ±9．5*12．5 25．5 ±10．1* 38．6 ±3．7* 36．3 ±9．7*25 42．0 ±10．2* 44．9 ±9．6* 47．8 ±2．9*50 42．5 ±9．7* 47．9 ±8．7* 63．7 ±11．3*100 51．8 ±6．0* 64．9 ±5．1* 77．6 ±5．9*順鉑組(5μg/ml)32．4 ±10．4* 56．8 ±9．1* 79．0 ±4．9*

3．2 GA對(duì)SMMC－7721細(xì)胞的生長(zhǎng)的影響

6．25 、12．5、25、50、100μmol/L 劑量組與陰性對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0．05)，對(duì)SMMC－7721細(xì)胞有增殖抑制作用，且呈劑量依賴關(guān)系，各濃度組對(duì)細(xì)胞的抑制率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增高，呈現(xiàn)時(shí)間依賴關(guān)系(見表2)。

表2 沒食子酸作用24、48、72h對(duì)MMC－7721細(xì)胞增殖的影響(±s)

表2 沒食子酸作用24、48、72h對(duì)MMC－7721細(xì)胞增殖的影響(±s)

注:與陰性對(duì)照組比較，*P ＜0．05。

藥物濃度(μmol/L)與分組24h抑制率(%)48h抑制率(%)72h抑制率(%)陰性對(duì)照組0006．25 16．3 ±9．0* 20．0 ±5．6* 42．2 ±7．0*12．5 22．4 ±10．7* 31．0 ±4．6* 65．7 ±3．1*25 23．1 ±13．7* 49．4 ±2．9* 72．4 ±4．8*50 41．9 ±10．8* 56．1 ±4．5* 82．7 ±1．92*100 44．1 ±8．6* 58．3 ±2．8* 81．8 ±4．2*順鉑組(5μg/ml)18．6 ±8．1* 38．0 ±5．1* 53．5 ±3．2*

3．3 GA對(duì)LO2和SMMC－7721細(xì)胞影響的比較

由圖1－3可以看出，沒食子酸對(duì)LO2和SMMC－7721 都有增殖抑制作用;作用 24h 時(shí)，6．25、12．5、25、100μmol/L劑量組對(duì)LO2細(xì)胞的抑制高于SMMC－7721，50μmol/L劑量組對(duì)兩種細(xì)胞的抑制相仿;作用48h后，25、50μmol/L劑量組對(duì) SMMC－7721細(xì)胞抑制率開始高于對(duì)LO2細(xì)胞的抑制;作用72h后，6．25、12．5、25、50μmol/L 劑量組對(duì) SMMC－7721 細(xì)胞的抑制率明顯高于對(duì)LO2細(xì)胞的抑制，對(duì)二者抑制率的差距增大，但100μmol/L劑量組對(duì)LO2細(xì)胞的抑制還是與對(duì)SMMC－7721的抑制接近。

圖1 沒食子酸作用24h對(duì)兩種細(xì)胞增殖抑制

圖2 沒食子酸作用48h對(duì)兩種細(xì)胞增殖抑制

圖3 沒食子酸作用72h對(duì)兩種細(xì)胞增殖抑制

綜上可知，GA對(duì)LO2細(xì)胞和AMMC－7721細(xì)胞均有抑制作用;50μmol/L劑量組的GA對(duì)LO2的抑制較小，而對(duì)SMMC－7721的抑制較大。

4 討論

原發(fā)性肝癌(簡(jiǎn)稱肝癌)為常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人類健康和生命。該病發(fā)病早期無特異性表現(xiàn)，大部分患者就診時(shí)已處于中晚期階段，現(xiàn)行的常規(guī)的治療手段效果不甚理想。中醫(yī)藥治療肝癌在穩(wěn)定病灶、延長(zhǎng)生存時(shí)間、改善生存質(zhì)量等方面發(fā)揮了顯著的療效，不僅單用有效，而且可與手術(shù)、放療、化療聯(lián)合運(yùn)用提高臨床療效和減少毒副反應(yīng)。

GA作為天然植物中提取的多酚類化合物具有抗氧化、抗自由基作用。然而在金屬離子存在的情況下GA表現(xiàn)為強(qiáng)氧化劑的作用［5］，促進(jìn)細(xì)胞 DNA的損傷，誘導(dǎo)其凋亡，而這種損傷是可以被過氧化氫酶阻止［6］。有研究表明，細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶在細(xì)胞中的含量高低決定了對(duì)GA的敏感性不同［7］，近年來GA的抗腫瘤作用越來越受到人們的重視。

鑒于絕大多數(shù)的化療藥物對(duì)正常細(xì)胞殺傷作用也很大，我們采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GA對(duì)正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用，期望能為尋找有效的減毒增效拮抗劑提供線索。結(jié)果表明，抗腫瘤單體GA對(duì)LO2和SMMC－7721細(xì)胞均有一定的毒性，表現(xiàn)為增殖抑制作用，作用早期(24h)對(duì)LO2的抑制大于對(duì)SMMC－7721的抑制，連續(xù)作用后(48h、72h)，對(duì)SMMC－7721細(xì)胞的損傷明顯超過對(duì)LO2的抑制。綜上所述，在充分發(fā)揮GA抗腫瘤作用的情況下，如何降低其對(duì)正常細(xì)胞的影響，需要進(jìn)一步研究。

［1］ 李玉東，刁勇，王立強(qiáng)．芍藥及其有效成分抗腫瘤作用的研究進(jìn)展［J］．海峽藥學(xué)，2009，21(12):27－32．

［2］ Lo C，Lai TY，Yang JS，et al．Gallic acid inhibits the migration and invasion of A375．S2 human melanoma cells through the inhibition of matrix metalloproteinase－2 and Ras［J］．Melanoma Res，2011，21(4):267－273．

［3］ You BR，Kim SZ，Kim SH，Gallic acid－induced lung cancer cell death is accompanied by ROS increase and glutathione depletion［J］．Mol Cell Biochem，2011，357(1－2):295－303．

［4］ 梁穎，張曉莉，陶冀，等．紅花多糖對(duì)人肝癌SMMC－7721細(xì)胞增殖的抑制作用［J］．中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2011，39(5):32－35．

［5］ Inoue M，Suzuki R，Sakaguchi N，et al．Selective induction of cell death in cancer cells by gallic acid［J］．Biol Pharm Bull，1995，18(11):1526－1530．

［6］ Yoshino M，Haneda M，Naruse M，et al．Prooxidant action of gallic acid compounds:copper－dependent strand breaks and the formation of 8－h(huán)ydroxy－2＇－deoxyguanosine in DNA［J］．Toxicol In Vitro，2002，16(6):705－709．

［7］ Isuzugawa k，Inoue M，Ogihara Y．Catalase contents in cells determine sensitivity to the apoptosis inducer gallic acid［J］．Biol Pharm Bull，2001，24(9):1022－1026．