毛脈酸模無菌苗的制備及下胚軸愈傷組織誘導的研究

謝彥梅，許巖，常豐華，沈劍，王振月

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

毛脈酸模(Rumex gmelini Turcz．)為蓼科酸模屬植物，民間以根及根莖入藥，以治療淋病、癬病、瘡毒、止血、腫瘤和調血脂等著稱［1］。其根中富含白藜蘆醇及白藜蘆醇苷、酸模素、大黃酚、大黃素等化合物［2－5］。利用植物組織培養生產次生代謝產物具有保護植物資源、生產周期短、不受地區和季節限制、利于生物轉化，尋找新的有效藥物成分等優點［6］。但毛脈酸模組織培養時，盆栽的毛脈酸模幼苗發芽率低、生長周期長、幼苗較嫩，進行外植體消毒時易于脫水，失去活力不利于誘導愈傷組織、叢生芽等。從無菌苗得到的外植體不需消毒，外植體活力較高，所以筆者研究毛脈酸模無菌苗的制備，并比較了不同激素種類或組合對毛脈酸模下胚軸愈傷組織誘導的影響，旨在為今后的組織培養奠定基礎。

1 材料與試劑

毛脈酸模種子采自黑龍江中醫藥大學藥用植物園。表面消毒劑選用75%的酒精、0．1%的HgCl2溶液和NaClO溶液。NaClO溶液原液(有效氯≥10．0%)購自天津市進豐化工有限公司。

2 方法

2．1 摩擦種皮對種子發芽的影響

挑選粒大飽滿的種子，用120目砂紙摩擦去掉種皮，蒸餾水浸泡24h，第1次消毒時種子在75%的酒精中浸2min，再將其用10%NaClO溶液處理10min，放置在帶有兩層濕潤的無菌濾紙的培養皿中10h，再進行第2次消毒，用10%NaClO溶液處理8min，無菌水沖洗5次后，無菌濾紙吸干表面水分，接種于培養基(MS+3%蔗糖+0．9%瓊脂)中，每皿接種種子20粒，置于光照恒溫培養箱中培養，培養溫度(25±2)℃，光照14h/d，光照強度1500～2000Lx。觀察初始發芽時間，每2天調查1次材料污染情況，培養10天后統計污染率和發芽率。以不去種皮的種子為對照。

2．2 不同浸泡時間和消毒次數對種子消毒效果的影響

挑選粒大飽滿的種子，120目砂紙摩擦去掉種皮，分別用蒸餾水浸泡0、12h、24h、36h后進行消毒。第一次消毒后每組分別取出一半的種子培養，另一半進行第2次消毒。具體消毒、培養和統計方法如2．1。

2．3 消毒劑種類與消毒時間對種子消毒效果的影響

挑選粒大飽滿的種子摩擦去皮浸泡24h，將其用75%的酒精浸泡2min后分成四組，分別用10%NaClO溶液處理 10min、15min;0．1%的 HgCl2溶液處理5min、7min。消毒后分別放置在帶有兩層濕潤的無菌濾紙的培養皿中10h，進行第2次消毒，每組較第1次的消毒時間減2min。具體消毒、培養和統計方法如2．1。

2．4 貯存時間對種子發芽的影響

將新種子和貯存一年、兩年的種子按2．1的方法消毒、培養和統計。

2．5 下胚軸誘導愈傷組織

用接種刀將無菌苗的下胚軸切割，接種到不同激素濃度的MS培養基上，進行愈傷組織的誘導培養。實驗重復3次。培養30天觀察統計愈傷組織的生長狀況。

3 結果與分析

3．1 摩擦種皮

種子經砂紙摩擦、浸泡、消毒、培養一段時間后的結果如表1所示，種子發芽時間、污染率和發芽率都與未處理的種子差異明顯。摩擦處理的種子1天就開始發芽，無污染，發芽率達到了81．8%。種皮障礙是毛脈酸模種子發芽率低的主要原因之一。毛脈酸模種子種皮堅硬，硬實種子可采用多種方法損傷種皮，以達到促進萌發的目的，如溫度處理、切除種皮、碾磨擦傷種皮、濃硫酸腐蝕種皮、有機溶劑浸漬去除種皮上的脂類物質等［7］。本實驗采用摩擦種皮的方法使發芽率得到顯著提高。

表1 摩擦種皮對種子發芽的影響

3．2 浸泡時間和消毒次數對消毒效果的影響

浸泡時間和消毒次數對消毒效果的影響如表2所示。通過不同浸泡時間和消毒次數對種子處理后，觀察統計結果表明，經過兩次消毒的種子與一次消毒的種子相比污染率明顯降低，初始發芽時間和發芽率沒有明顯差異，控制污染是組培過程中的首要技術［8］，所以選擇兩次消毒是比較合理的。浸泡24h的種子發芽率明顯高于未浸泡和浸泡12h、36h的種子，說明種子浸泡24h是適合萌發的最佳條件。

表2 浸泡時間和消毒次數對消毒效果的影響

3．3 最佳消毒劑和消毒時間的選擇

表3所示，10%NaClO溶液作為毛脈酸模種子的消毒劑時消毒效果最好，其成苗率優于0．1%HgCl2溶液消毒法。10%NaClO溶液浸種10min與15min消毒效果相比較，消毒10min的種子開始發芽時間短，發芽率相對較高，效果明顯。

表3 不同消毒劑和消毒時間效果比較

3．4 種子貯存時間對發芽的影響

分別取不同貯存時間的種子研究對比，結果如表4，種子貯存時間越長，開始萌發時間越晚，發芽率越低。可能是因為種子隨著貯存時間的增長，活力開始下降。說明組織培養最好用當年新采收的種子。

表4 貯存時間對發芽的影響

3．5 不同濃度激素組合對毛脈酸模愈傷組織發生的影響 見表5。

表56－BA和2，4－D配比對下胚軸愈傷組織誘導的影響

觀察表明，下胚軸接種10天后，有的培養基上開始形成愈傷組織。由表5可見，當激素6－BA濃度不變時，激素2，4－D濃度在1．5～3 mg/L范圍內，愈傷組織誘導率較高。觀察統計表明，6－BA濃度為3．0mg/L、2，4－D 濃度為 1．7mg/L配合使用時，不僅愈傷組織的誘導率為100%，而且愈傷組織的生長速度快，長勢好。初期誘導形成的愈傷組織為半透明淡黃色，隨著培養時間的延長，伴隨著愈傷組織的生長，逐漸形成顆粒狀、質地疏松的愈傷組織。一般認為，這種愈傷組織為具有分化能力的愈傷組織［9－10］。綜合考慮，MS+3．0mg/L 6－BA+1．7mg/L 2，4－D 的激素組合是下胚軸愈傷組織誘導的最佳培養基，該培養基誘導形成的愈傷組織可以為未來愈傷組織形成再生植株和懸浮細胞的培養提供大量的材料。

4 小結與討論

筆者系統研究了建立毛脈酸模無菌苗培養體系的最佳方法、下胚軸愈傷組織誘導的最佳培養基。獲得毛脈酸模無菌苗的方法是:挑選粒大飽滿的新種子，120目砂紙摩擦種皮，蒸餾水浸泡24h，在75%酒精中浸2min，無菌水沖洗3次，再將其用10%NaClO溶液處理10min，無菌水沖洗5次，將其放置在有兩層濕潤的無菌濾紙的培養皿中10h，再進行第二次消毒，用10%NaClO溶液處理8min，無菌水沖洗5次，再將其在無激素的MS培養基中培養即可獲得大量無菌苗;下胚軸愈傷組織誘導的最優培養基為MS+3．0mg/L 6－BA+1．7mg/L 2，4－D。消毒是植物組織培養中無菌苗培養的首要工作，而NaClO、HgCl2是常用的兩種消毒劑，本實驗0．1%HgCl2溶液處理后的無菌苗雖然無污染，但發芽時間長，發芽率低，可能0．1%HgCl2對毛脈酸模種子有較強的毒害作用，從而抑制其萌發［11］。汞脅迫對毛脈酸模種子生長發育有抑制作用，查閱文獻［12］發現，其機理可能是重金屬元素Hg對植物體內酶活性有影響，根據這一現象推測毛脈酸模可能作為汞脅迫的指示植物。從無菌苗上獲得的組織器官作為外植體進行愈傷組織、叢生芽誘導時無需消毒，活力高。從筆者前期實驗研究對比發現，誘導率明顯提高，愈傷組織長勢好，可以為懸浮細胞培養提供大量的材料，為今后內生真菌與細胞或者組培苗相互作用，可能產生有效藥物成分奠定基礎。

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