德宏水牛及其雜交后代染色體多態性分析

宋敏艷，高文春，尹正發，楊明超，佴文惠，胡 怡，毛華明，4，史憲偉＊

（1.云南農業大學動物科學技術學院，云南 昆明650201；2.云南省盈江縣畜牧獸醫局，云南 盈江679300；3.中國科學院昆明動物研究所 遺傳資源與進化國家重點實驗室，云南 昆明650223；4.云南省反芻動物工程技術研究中心，云南 昆明650201）

德宏水牛主產于云南省西部德宏地區盈江縣、瑞麗市、潞西市、隴川縣、梁河縣和保山、臨滄等地區的15個縣市，是全國優良地方八大水牛品種之一，素以體型大、體質強健、性情溫馴、耐粗飼、適應性強、繁殖力強、產肉性能高而出名［1］。

德宏水牛為役用型水牛，產奶產肉能力較低［2］。自1987年實施“中—歐德宏水牛開發項”以來，為提高德宏水牛的奶肉生產性能，引入印度摩拉水牛與巴基斯坦的尼里·拉菲水牛對德宏水牛進行了大規模的雜交改良［3］。到2009年末，德宏水牛存欄數10.20萬頭，其中已使用凍精配種1.23萬多頭次，雜交水牛1.52萬多頭，能繁母牛3.44萬多頭［4］。通過與河流型水牛進行雜交，雜交后代產奶與產肉性能顯著得到提高。然而，不同類型水牛雜交后代的染色體結構及數目均出現多態類型，研究德宏水牛及雜交后代染色體多態性遺傳規律及與生產性能的關系將為德宏水牛進一步雜交改良及品種選育提供科學依據。

家養水牛分為河流型與沼澤型水牛，河流型水牛染色體數為2n＝50，沼澤型水牛染色體數為2n＝48，兩者雜交后代可育，并且后代出現染色體多態性［5］。Berardino等［5］利用染色體分帶技術研究了河流型水牛與意大利沼澤型水牛染色體特征，黃右軍等［6］對廣西本地沼澤型水牛與河流型摩拉水牛的核型進行了比較分析，其研究結果均表明：沼澤型水牛染色體數為2n＝48，摩拉水牛為2n＝50，兩種類型雜交后代染色體數為2n＝49；沼澤型水牛少了一對河流型摩拉水牛核型中的9號端著絲粒染色體；沼澤型水牛1號染色體為一大的中著絲粒染色體，推測其可能是由河流型水牛4號和9號染色體發生端粒－著絲粒串聯融合形成。除此之外，沼澤型水牛與河流型水牛的其余染色體在染色體結構、帶型以及著絲粒和核仁組織區都完全一致，這說明河流型水牛與沼澤型水牛染色體具有高度的同源性或一致性。

Harisah等［7］對75頭純種水牛和198頭來自菲律賓與馬來西亞的雜交水牛進行了染色體分析。結果表明：沼澤型水牛染色體數為2n＝48，河流型水牛染色體數為2n＝50；雜交一代染色體數均為2n＝49；雜交二代產生三種不同的染色體核型：2n＝48，2n＝49，2n＝50；與親本回交則出現2n＝49和2n＝50兩種染色體核型。經卡方檢驗，雜交二代不同核型的分離比為1∶2∶1，回交后代的核型分離比接近1∶1。黃右軍等［8］分析了河流型摩拉和尼里／拉菲水牛（2n＝50）與我國本地水牛（2n＝48）雜交后代的染色體核型，發現三元雜（尼里X摩雜一代／二代）出現2n＝49和2n＝50兩種組型，其分離比也接近1∶1。但是，德宏水牛及雜交后代染色體核型特征及多態性遺傳規律尚未見報道。

本文對采集的具有不同繁殖性能的20頭德宏本地水牛、25頭摩拉與德宏二元雜水牛以及35頭尼里與摩拉和德宏三元雜水牛進行了染色體核型分析，以期為德宏水牛的品種保護利用及雜交改良提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗的水牛樣品來自云南省德宏傣族景頗族自治州盈江縣舊城、新城和平原3個鄉（鎮）。共采集了德宏本地水牛20頭（♀15頭，♂5頭），其中6歲以上并配種3次以上均未受孕母牛5頭，其余10頭母牛繁殖性能良好；摩拉與德宏二元雜交水牛25頭（♀21頭，♂4頭），其中6歲以上并配種3次以上均未受孕的11頭，其余10頭母牛繁殖性能良好；尼里與摩拉和德宏三元雜交水牛35頭（其中：♀31頭，♂4頭），由于年齡都在2～4歲之間，尚沒有繁殖性能的完整記錄。在采樣時，詳細記錄水牛的性別、毛色、年齡、外貌特征、父母及后代等特征特性，對于年齡在6歲以上，經過多次配種而未受孕的母牛定義為存在繁殖障礙。對以上繁殖異常水牛進行了外陰與生殖道直腸檢查，未發現性器官明顯異常。每頭水牛均由頸靜脈采集血液樣品，部分個體采集了耳組織樣品。

1.2 樣品采集

采血：用碘酒和酒精對牛頸靜脈處皮膚進行消毒，用滅菌注射器或采血針采血1～2mL，置于肝素抗凝的采血管中，常溫下及時帶回實驗室。

耳組織取材：用手術刀片將牛耳皮上的毛發及附在其上的臟物刮除干凈，用酒精棉球仔細擦拭幾遍牛耳取材部位，用滅菌的小剪刀剪取一部分耳緣皮膚，將其迅速放入盛有培養基的小瓶子中常溫保存，及時帶回實驗室。

1.3 細胞培養、G－帶染色體及染色體核型分析

參照人外周血淋巴細胞培養法［9］與 Seabright［10］的G－帶染色法并略作修改制備中期染色體及G－帶染色體標本，對顯帶和分散較好的分裂相用CytoVision System （Applied Imaging）軟件進行圖像拍攝和分析。

1.4 統計分析

尼里與摩拉和德宏三元雜水牛染色體分離比例采用χ2檢驗進行分析。

2 結果與分析

2.1 德宏水牛及雜交后代染色體核型分析

挑選形態清晰、顯帶和分散良好、收縮適中的染色體中期分裂相，進行顯微拍照，并統計染色體數目。結果顯示，檢測的20頭德宏水牛的染色體數目均為2n＝48，染色體臂數為NF＝58，23對常染色體，其中1號染色體是一對大的中部著絲粒染色體，2號染色體為亞端著絲粒染色體，3號為亞中著絲粒染色體，4～5號是中著絲粒染色體，6～23號是端著絲粒染色體，1對性染色體中X染色體是最大的端著絲粒染色體，Y染色體是小型端著色粒染色體（圖1～A），與廣西本地水牛［11］及德昌水牛［12］的核型一致，符合沼澤型水牛的染色體數目與特征，為德宏水牛屬于沼澤型水牛類型提供了細胞遺傳學證據。25頭摩拉與德宏二元雜水牛染色體數目均為2n＝49，47條常染色體，1對性染色體（圖1～B）。35頭尼里×（摩拉×德宏）三元雜水牛出現2n＝49與2n＝50兩種染色體核型（圖1～C，D）。三元雜2n＝49核型特征與二元雜2n＝49水牛一致。而三元雜2n＝50水牛核型中，24對常染色體，1對性染色體，與1994年CSKBB［13］確定的河流型水牛的標準核型一致。

將德宏水牛染色體核型與二元雜和三元雜后代染色體核型進行比較發現：德宏水牛2n＝48核型中少了一對三元雜2n＝50水牛核型中的9號端著絲粒染色體；德宏水牛1號染色體為一對大的中著絲粒染色體（圖1～A紅圈標注），2n＝50水牛1號染色體為一對亞中著絲粒染色體；德宏水牛1號染色體的G－帶與2n＝50水牛4號和9號染色體相吻合（圖1～D紅圈標注），染色體長度近同，因此推測沼澤型水牛1號染色體可能是由河流型水牛4號和9號染色體發生端粒－著絲粒串聯融合形成的，這與Berardino等［5］報道的結果一致；2n＝49核型中的9號染色體不配對，4號染色體為兩條形態不同的染色體，一條為巨大4／9易位中著絲粒染色體，另一條為較小的原9號端著絲粒染色體（圖1～B，C紅圈標注）。

2.2 水牛染色體核型與繁殖性能的關系

對采集的20頭德宏水牛和25頭摩拉與德宏二元雜水牛的繁殖記錄與染色體核型進行分析，德宏水牛染色體數均為2n＝48，摩拉與德宏二元雜水牛均為2n＝49。雖然我們采集的德宏水牛和摩拉與德宏二元雜水牛均包括了配種及產仔數異常的母牛，但沒有檢測到染色體畸變現象，在有記錄的繁殖障礙與繁殖性能優良的個體間也沒有檢測出染色體差異。而采集的35頭尼里×（摩拉×德宏）三元雜水牛年齡都在2～4歲之間，尚沒有繁殖性能的完整記錄，因此三元雜染色體多態性與繁殖性能的關系有待進一步研究。

圖1 德宏水牛及雜交后代染色體核型

2.3 德宏水牛及雜交后代染色體多態性遺傳規律分析

德宏水牛染色體數為2n＝48，屬沼澤型水牛，其與河流型摩拉水牛雜交，雜交一代染色體數為2n＝49。隨著雜交代數的增加，雜交二代（三元雜）出現兩種染色體核型，分別為2n＝49，2n＝50；其中2n＝49核型占20頭，2n＝50類型占15頭，經卡方檢測，χ2＝0.45714，χ2＜，P＞0.05，因此2n＝49和2n＝50兩種類型的核型分離比符合1∶1的關系。值得一提的是，無論2n＝49或2n＝50都呈現染色體平衡遺傳，即兩種類型染色體的DNA總量沒有出現明顯的重復和丟失，基因的總量基本相等。對摩拉與德宏水牛二元雜水牛2n＝49核型進行分析，該核型中有3條不能配對的常染色體。黃右軍等［8］、梁夢玫等［14］、馬彩霞等［15］對其減數分裂聯會復合體及其精子染色體進行研究與分析發現，正是由于這3條不配對的常染色體，在減數分裂粗線期形成一條三價體聯會復合體，后期Ⅰ分離時，進行平衡分離產生兩種正常配子，n＝24和n＝25，兩種配子的染色體數目雖然不同，但遺傳物質總量是平衡一致的。當2n＝49水牛與2n＝50河流型尼里水牛雜交時，導致其子代出現染色體多態性：2n＝50，2n＝49。進行不平衡分離產生兩種異常配子，n＝24＋1和n＝25－1，異常配子與正常配子結合時，則導致非整倍性變異，同源染色體配對出現異常而致胚胎不能存活。本實驗檢測的35頭尼里×（摩拉×德宏）三元雜水牛染色體均由正常配子結合，未出現異常配子結合類型。

3 結論與討論

家養水牛分為河流型與沼澤型水牛，河流型水牛染色體數為2n＝50，沼澤型水牛染色體數為2n＝48。與馬和驢、黃牛與牦牛及雞與鵪鶉等不同染色體數目的物種之間雜交后代不育或單性不育不同，河流型與沼澤型水牛雜交后代雙性均可育，并且出現染色體多態類型［5，7］。仔細查看河流型與沼澤型水牛染色核型及染色體多態性特征，可發現它們的染色體差異涉及兩對非同源染色體，即河流型水牛4號和9號染色體易位形成沼澤型水牛1號染色體。染色體易位包括單向易位、羅伯遜易位及串聯易位，從圖1可看出，沼澤型水牛1號染色體是由河流型水牛4號和9號染色體串聯易位而成，并且是由9號端著絲粒染色體與4號亞中著絲粒染色體的短臂（p臂）發生串聯融合。與其他易位類型不同，串聯易位形成的新染色體與原染色體在染色體長度、DNA含量之間差異較小，這可能就是河流型與沼澤型水牛雜交后代可育并出現染色體多態性的主要原因。具體這種串聯易位的起源與進化機制以及串聯融合所帶來的遺傳效應與表型效應尚待進一步研究。

雖然我們在樣品采集與染色體分析過程中，有意識的選擇了有明顯繁殖障礙的德宏水牛及摩拉與德宏雜交水牛，期望找到與繁殖障礙有關的染色體變異，然而德宏水牛及二元雜后代不同繁殖性能個體間無論在染色體核型、G帶帶型還是染色體數目方面均無顯著差異。黃右軍等［6］比較了三元雜水牛2n＝49與2n＝50出產月齡、妊娠期、產后第一次發情、產仔間隔、情期受胎率及年受胎率等繁殖性能，發現2n＝49個體比2n＝50個體情期配種受胎率降低12.3%，年受胎率降低6.4%。由于本實驗采集的35頭尼里×（摩拉×德宏）三元雜水牛年齡都在2～4歲之間，尚沒有繁殖性能的完整記錄，因此德宏水牛三元雜后代染色體多態性與繁殖性能的關系有待進一步研究。

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