固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP基因多態(tài)性與肉用性狀關(guān)系的研究

滑留帥，楊曉冰，楊 奇，胡沈榮，陳 宏＊

引言

固原市位于寧夏回族自治區(qū)南部山區(qū)，是一個(gè)歷史悠久的肉牛基地。固原本地的黃牛品系，基本是陜西秦川牛的后裔或直接從陜西引進(jìn)的秦川牛，以役用為主。上個(gè)世紀(jì)70年代，政府開(kāi)始有組織的進(jìn)行黃牛雜交改良，先后引進(jìn)過(guò)短角牛、西門(mén)塔爾牛等國(guó)外優(yōu)良品種進(jìn)行雜交改良，但推廣范圍都有限。2000年以后，固原市推行退耕還林還草政策，并把草畜產(chǎn)業(yè)作為第一支柱產(chǎn)業(yè)，大力推廣利木贊牛的雜交改良，目前已有很大的利木贊牛雜交群體。

脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acid－binding proteins，F(xiàn)ABPs）是一族分子質(zhì)量為14kD～16kD的蛋白質(zhì)，廣泛存在于哺乳動(dòng)物的小腸、肝、心、腦和骨骼肌等多種細(xì)胞內(nèi)，并且含量豐富［1］，目前，已發(fā)現(xiàn)9種組織特異性的胞質(zhì)FABP，其中 H－FABP（heart fatty acid－binding proteins，H－FABP）對(duì)動(dòng)物脂肪代謝有重要作用，H－FABP在細(xì)胞內(nèi)與脂肪酸結(jié)合，使細(xì)胞內(nèi)外保持一定的脂肪酸濃度差，促進(jìn)細(xì)胞攝取脂肪酸［2，3］，H－FABP基因敲除小鼠表現(xiàn)出對(duì)外圍長(zhǎng)鏈脂肪酸利用的嚴(yán)重缺陷。FABP家族成員還與細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的調(diào)節(jié)有關(guān)，H－FABP能調(diào)節(jié)新生小鼠心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化、它還能刺激細(xì)胞表面積的增加，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞的肥大［4］；而且，H－FABP尤其抑制小鼠正常乳房上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，H－FABP還被認(rèn)為是乳房腫瘤的抑制基因。種間H－FABP基因編碼區(qū)有很高的同源性，這不僅表現(xiàn)在所編碼的氨基酸上，還表現(xiàn)在DNA序列上［5］。所有FABP基因家族成員基因結(jié)構(gòu)都是保守的，有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成［6］，研究證實(shí)H－FABP基因是影響脂肪性狀的主要候選基因［7］，從而對(duì)肉品質(zhì)有重要影響，由于其影響脂肪代謝，并同時(shí)推測(cè)其對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育也存在影響。

本研究利用PCR－RFLP研究了固原本地黃牛及其利木贊牛雜交群體H－FABP－HaeIII位點(diǎn)多態(tài)性及其與屠宰性狀和肉品質(zhì)性狀的關(guān)系，以期為固原本地黃牛下一步的雜交改良提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料為隨機(jī)抽取的41頭固原本地黃牛和121頭利木贊牛與固原本地黃牛的雜交1代牛（簡(jiǎn)稱利雜牛），頸靜脈采血，ACD抗凝，－80℃保存。然后在其中選取18月齡和6月齡利雜牛公牛各6頭，18月齡和6月齡固原本地公牛各6頭，共計(jì)24頭進(jìn)行6個(gè)月的育肥試驗(yàn)后，進(jìn)行屠宰性能測(cè)定和肉品質(zhì)測(cè)定。屠宰試驗(yàn)在寧夏六盤(pán)山?jīng)芎忧逭媸称酚邢薰具M(jìn)行。

1.2 主要試劑

蛋白酶K、Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶HaeIII等購(gòu)自MBI（Fermantas）和上海生物工程有限公司。

1.3 固原本地黃牛及其利雜群體基因組DNA的提取

血樣基因組DNA的提取采取酚氯仿法［8］。

1.4 固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP基因的PCR擴(kuò)增

引物序列參考文獻(xiàn)［13］，上游序列5′－ AGCCTACCACAATCATCGAAGTGAA －3′；下游序列 5′－ CAAGTGATGTCTCTTGTCCATTCCA－3′，由上海生物工程公司合成。PCR反應(yīng)體系為25μL：10×Buffer 2.5μL，MgCl2（25mmol／L）2.0 μL，dNTPs（2.5mmol／L）2.0μL、Taq DNA 聚合酶（2U／μL）0.5μL，上下游引物（10pmol／μL）各0.4μL，模板 DNA（50ng／μL）1.5μL，加三蒸水至25μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，（94℃變性30s，65℃復(fù)性45s，72℃延伸1min）34個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。

1.5 固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP基因PCR－RFLP分析

圖1 固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP基因PCR產(chǎn)物電泳圖

酶切反應(yīng)體系：10×緩沖液R（含BSA）2μL，HaeⅢ（10U／μL）0.7μL，PCR產(chǎn)物10μL，補(bǔ)三蒸水至20μL，經(jīng)瞬時(shí)離心后置于37℃恒溫水浴搖床中消化過(guò)夜，消化后PCR產(chǎn)物用4g／L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、成像。

1.6 數(shù)據(jù)分析

基因型與基因頻率、適合性χ2檢驗(yàn)均利用POPGENE軟件完成。與生產(chǎn)數(shù)據(jù)的相關(guān)分析采用最小二乘線性模型，不同育肥階段的方差分析模型如下：Y＝μ＋breed＋marker＋e其中：Y為個(gè)體表型的記錄值；μ為群體平均值；breed為品種效應(yīng)；marker為標(biāo)記基因型效應(yīng)；e為隨機(jī)誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP基因的PCR－RFLP分析

固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP基因PCR產(chǎn)物片段大小為2 075bp（圖1），用 HaeIII限制性內(nèi)切酶消化后表現(xiàn)多態(tài)性（圖2，只顯示部分多態(tài)片段）：AA型表現(xiàn)為7條帶，片段大小分別為73 bp、124bp、146bp、169bp、312bp、599bp、653bp，BB型表現(xiàn)為8條帶分別為73bp、124bp、146bp、169bp、166bp、312bp、487bp、599bp，即在 AA型中的653bp的片段在BB型中被切為166bp和487 bp，AB型表現(xiàn)為9條帶，分別73bp、124bp、146 bp、169bp、166bp、312bp、487bp、599bp、653bp，即在雜合子中所有片段大小的帶都出現(xiàn)。然而僅就487bp、599bp、653bp三條帶就能將牛進(jìn)行分型（圖2）。

2.2 固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP－HaeⅢ基因座的遺傳多態(tài)性分析

固原本地黃牛及其利雜群體的H－FABP基因座經(jīng)HaeIII的酶切后表現(xiàn)多態(tài)性，且均在該位點(diǎn)處于Hardy－Weinberg平衡狀態(tài)；等位基因A／B頻率分別為0.7439／0.2561和0.7190／0.2810，利雜群體位點(diǎn)雜合度、多態(tài)信息含量、有效等位基因數(shù)均大于固原本地黃牛群體。

圖2 固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP－HaeⅢ基因座酶切電泳圖

表1 固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP－HaeⅢ基因座的遺傳多態(tài)性指標(biāo)

2.3 固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP－HaeⅢ基因座不同基因型與部分屠宰性狀和肉品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

考慮品種效應(yīng)、標(biāo)記基因型效應(yīng)及其它們之間的互作，在不同年齡階段對(duì)屠宰性狀和肉品質(zhì)性狀進(jìn)行兩因素方差分析，由表2可知：AB型個(gè)體的心重大于AA型個(gè)體，差異顯著（P＜0.05）；而腎脂肪重、脂肪色澤評(píng)分、眼肌面積、系水力、粗脂肪含量，AB型個(gè)體均高于AA型個(gè)體，同時(shí)AB型個(gè)體的肌肉剪切力、粗蛋白含量小于AA型個(gè)體，但差異不顯著（P＞0.05）。

表2 固原本地黃牛及其利雜群體H－FABP－HaeⅢ基因座基因型間最小二乘均值差異顯著性檢驗(yàn)

3 討論

固原本地黃牛及其利雜群體的H－FABP基因座經(jīng)HaeIII的酶切后表現(xiàn)多態(tài)性，且均在該位點(diǎn)處于Hardy－Weinberg平衡狀態(tài)，說(shuō)明在這個(gè)位點(diǎn)受到的選擇壓力不大，這可能是因?yàn)镠－FABP基因與脂肪性狀或肉品質(zhì)性狀相關(guān)，而這些性狀都是不太容易測(cè)量的，所以在選種時(shí)，選擇強(qiáng)度可能不大，目前在肉牛業(yè)越來(lái)越重視肉品質(zhì)的趨勢(shì)下，應(yīng)該在以后的選種過(guò)程中加大選擇的力度，提高群體的肉品質(zhì)水平。利雜群體位點(diǎn)雜合度、多態(tài)信息含量、有效等位基因數(shù)均大于固原本地黃牛群體，說(shuō)明用利木贊牛的雜交改良豐富了固原本地黃牛在該位點(diǎn)上的遺傳資源，為后期的選種工作提供了更豐富的素材，同時(shí)，用利木贊牛的雜交改良提高了固原本地黃牛群體中B等位基因的基因頻率。

脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acid－binding proteins，F(xiàn)ABPs）在脂肪酸生成過(guò)程中具有重要的生物學(xué)功能，參與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的運(yùn)輸，調(diào)整細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的濃度。它們能在心肌和脂肪細(xì)胞中沉積甘油三酯，這是增加肌內(nèi)脂肪含量（intramuslar Fat，IMF）的主要方向，10%左右的IMF可產(chǎn)生理想的大理石花紋，從而形成優(yōu)質(zhì)高檔牛肉［9］。據(jù)研究，牛肉大理石花紋性狀與牛肉的嫩度高度相關(guān)，較高水平的大理石花紋可以提高牛肉的嫩度、多汁性和風(fēng)味，減少牛肉在烹調(diào)過(guò)程中嫩度的變化。目前對(duì)H－FABP基因的研究多集中在豬上和雞上，少數(shù)涉及牛，Gerbens等［10］利用侯選基因法的研究表明H－FABP基因的遺傳變異與肌內(nèi)脂肪含量存在相關(guān)，在杜洛克豬中存在MspI、HaeIII和HinfI酶三個(gè)多態(tài)性酶切位點(diǎn)，并初步發(fā)現(xiàn)H－FABP基因的純合單倍體“aa dd HH”與高肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)，H－FABP基因被認(rèn)為是影響肌內(nèi)脂肪沉積的主效基因。龐衛(wèi)軍等（2005）報(bào)道，利用 PCR－RFLP（MspI、HaeIII和HinfI3種限制性內(nèi)切酶）分子標(biāo)記技術(shù)，檢測(cè)了杜洛克豬、長(zhǎng)白豬、大白豬、內(nèi)江豬、榮昌豬、漢江黑豬、漢中白豬、八眉豬和野豬共計(jì)265頭豬H－FABP基因5＇－上游區(qū)和第二內(nèi)含子區(qū)的遺傳變異，并利用最小二乘模型分析了H－FABP基因?qū)ωi肌內(nèi)脂肪含量的遺傳效應(yīng)。結(jié)果表明，H－FABP基因可顯著地提高IMF含量（P＜0.05），可以通過(guò)提高“aa－dd－HH”基因型的頻率達(dá)到改善群體豬肉質(zhì)的目的［11］。李文娟等（2006）利用RT－PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分析了H－FABP基因與雞肌內(nèi)脂肪沉積的關(guān)系，結(jié)果表明，H－FABP基因mRNA隨日齡的增長(zhǎng)表達(dá)量顯著降低，北京油雞、白萊航雞和AA雞群體的H－FABP基因mRNA表達(dá)水平與IMF含量及胴體重呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)［12］。周國(guó)利等［13］報(bào)道，魯西黃牛H－FABP基因中BB純合基因型對(duì)牛肉嫩度剪切力值有較大的影響（P＜0.05），同時(shí)，對(duì)于腎脂肪重、脂肪色澤評(píng)分、眼肌面積、系水力等指標(biāo)，AB型均高于AA型，在本試驗(yàn)研究的群體中，除心重指標(biāo)AB型顯著大于AA型（P＜0.05）外，基因型對(duì)腎脂肪重、脂肪色澤評(píng)分、眼肌面積、肌肉嫩度、系水力、肉品粗脂肪含量等指標(biāo)均影響不顯著，但都呈現(xiàn)AB基因型優(yōu)于AA型的趨勢(shì)，初步認(rèn)為B等位基因與優(yōu)良生產(chǎn)性能相關(guān)。本研究因?yàn)闃颖玖肯拗疲瑳](méi)有檢測(cè)到BB型個(gè)體，應(yīng)該進(jìn)一步擴(kuò)充樣本量，使BB型數(shù)量到可統(tǒng)計(jì)的水平，以提高研究的準(zhǔn)確性。

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