MPEG-PLGA納米膠囊在真核質粒轉染細胞中的應用

涂心明，郭紹芳，胡伊樂

基因治療是近些年來興起的通過植入外源性治療基因片段，治療各種基因缺陷性疾病的一種新型疾病治療方法。基因治療時需將治療性目的基因片段插入真核質粒并轉入機體細胞，通過目的基因在體內的表達糾正某些基因缺陷，以達到治療疾病的目的[1]。由于大多數治療用真核質粒攜帶負電荷與細胞膜自身電荷相同，靜電排斥作用使自然情況下裸質粒穿越細胞膜的幾率較低，很難達到治療濃度[2]。為增加真核質粒穿越細胞膜的幾率，目前常用的方法有增加細胞膜通透性的氯化鈣、電擊、基因槍等方法[3]，由于對機體細胞有損傷，多用于實驗研究，臨床應用較少。MPEG-PLGA(聚乳酸-羥基乙酸共聚物)是一類可降解的功能高分子有機聚合物, 通過美國 FDA認證, 具有良好的生物相容性、無毒、無刺激性、無免疫原性和藥物緩釋等特性[4], 在臨床與科研中作為化學類藥物的給藥載體得到廣泛應用，作為真核質粒的跨膜轉運載體的研究，目前文獻報道較少。本實驗利用MPEG-PLGA包裹綠色熒光真核質粒，通過綠色熒光蛋白在細胞內的表達驗證其作為真核質粒跨膜載體的可行性。

1 材料與方法

1.1材料MPEG-PLGA購自山東濟南岱罡生物技術有限公司；四季青胎牛血清、DMEM培養基購自上海寶生物生物有限公司；pEGFP-C3綠色熒光真核質粒與NIH3T3細胞由河南科技大學醫學院人體解剖學實驗室保存；6孔細胞培養板、凍存管購自鄭州天根生物有限公司。

1.2方法

1.2.1 溶液的配制 ①MPEG-PLGA水溶液的制備：用三角瓶取雙蒸水20 mL，牛皮紙封口后高溫蒸汽消毒，待自然冷卻后置4℃冰箱過夜以備用，無菌環境下稱取MPEG-PLGA 300 mg，加入已消毒的4℃雙蒸水中，將三角瓶置于冰水混合物中震蕩使其溶解。待溶解完全后，置4℃冰箱保存備用。②MPEG-PLGA/DNA納米膠囊復合物的配制：取260 pg/mL的質粒300 μl加入到1 mL上述配制的MPEG-PLGA溶液中在冰水混合物中混勻，在此過程中盡量輕柔以防止破壞質粒結構，室溫放置15 min，置37℃恒溫箱中30 min,即可得到包裹pEGFP-C3的MPEG-PLGA/pEGFP-C3復合物。

1.2.2 復合物粒徑檢測 用Malvern粒度測定儀測其MPEG-PLGA/ pEGFP-C3復合物的粒徑。

1.2.3 細胞轉染試驗 ①細胞準備：液氮保存的細胞由于很多機能處于休眠狀態，為獲取理想的細胞活性，液氮中凍存的NIH3T3細胞復蘇后需傳3代以便細胞恢復正常活力，觀察細胞的形態與機能恢復正常后轉入6孔細胞培養板繼續培養，等細胞鋪滿培養皿底部達75%時將其分為2組，每組9孔細胞準備轉染。②細胞轉染：取去內毒素的MPEG-PLGA/pEGFP-C3復合物加入第1組培養孔中；將pEGFP-C3裸質粒加入第2組培養孔中以對照，將兩組混勻后靜置15 min，然后在37℃ 5%CO2培養箱中培養24 h后更換培養液繼續培養。③觀察與陽性細胞統計：培養48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察轉染效果，每孔在40倍視野下隨即選取6個視野，記錄每個視野中顯示綠色熒光的陽性細胞的數量，取均數進行統計學分析。

2 結果

2.1 MPEG-PLGA/DNA納米膠囊復合物的粒徑測定結果如圖1所示，納米粒粒徑呈單式正態分布，平均粒徑為28.3 nm，多分散系數為0.21，表明納米粒大小較均勻，分布范圍窄。

3.2細胞培養結果熒光顯微鏡下觀察可見，轉染24 h細胞有綠色熒光表達，48 h達高峰，兩組結果見圖2。裸質粒組不但熒光表達弱且僅有少量陽性細胞，轉染率不足3%，MPEG-PLGA/pEGFP-C3復合物組陽性細胞達15.3%，熒光表達強。結果證明MPEG-PLGA/pEGFP-C3復合物的轉染效果遠遠大于裸質粒。

圖1 MPEG-PLGA/DNA納米膠囊復合物粒徑

圖2 兩組轉染效果對比圖

3 討論

MPEG-PLGA由乳酸和羥基乙酸兩種單體聚合而成,具有良好的生物相容性,無毒、無刺激、無免疫原性和藥物緩釋等特性，特別是具有很好的中樞神經系統生物相容性，分子量0.5～20萬[5]，常作為一些水溶性差、自身性質不穩定、體內代謝快、生物利用度低類化學藥物的給藥載體，在應用中大多采用溶劑揮發法或透析法等制備微粒膠囊，這些方法大都涉及到二氯甲烷、乙腈、丙酮等有機溶劑的使用，殘留的有機溶劑不僅對人體具有很大危害，導致副作用的發生，而且容易破壞目的基因片段中DNA之間的鏈接，使其發生斷裂，在基因治療過程中不能正確表達治療蛋白。為了解決這一問題，本試驗利用共聚物比聚乳酸具有更大的親水性，并且具有溫敏水凝膠的特性(即其水溶液在4℃時完全溶于水，在37℃時變為水凝膠[6])提出了一種新型制備納米膠囊的方法——直接溶解法。該方法將MPEG-PLGA溶解于4℃的雙蒸水中，加入真核質粒混合后逐漸升溫至37℃，利用溫敏水凝膠的特性使其在形成凝膠顆粒時包裹游離在水溶液中的真核質粒，形成具有良好生物相容性的MPEG-PLGA/真核質粒復合物，該復合物穿越細胞膜后MPEG-PLGA凝膠顆粒在機體一些催化酶的作用下很快溶解釋放出真核質粒，質粒在細胞內表達相應蛋白從而起到治療疾病的目的，此方法在微粒膠囊制備時沒有劇烈的震蕩和有機溶劑的參與，可有效保護目的基因片段的完整性。本試驗中利用細胞內綠色熒光蛋白的表達觀察MPEG-PLGA/真核質粒復合物的轉染效率。試驗結果顯示MPEG-PLGA/真核質粒復合物組轉染效率(15.3%)明顯高于作為對照的裸質粒組(3%)，證明利用MPEG-PLGA包裹真核質粒可有效提高其轉染效率，另外根據MPEG-PLGA的特性，可通過改變聚合物單體比例和分子量，調控共聚物在體內的降解速度、DNA包封率以及基因體內釋放速度。試驗結果表明MPEG-PLGA可以作為一種新型跨膜載體在臨床與研究中得以應用。

參考文獻：

[1] Glorioso JC,Fink DJ.Herpes vector-mediated gene transfer in the treatment of chronic pain[J].Mol Ther,2009,17(1):13-18.

[2] 宗莉，陳伶俐，張淑蕓,等.殼聚糖納米粒作為基因載體的研究：制備，特征和對DNA的保護[J].中國藥科大學學報,2005,36(6):526-530.

[3] Richardson scw，Kolbe ⅣJ，Duncan R,et al.Potential of low molecular mass chitosan as a DNA delivery system：biocompatibility, body distribution and ability to complex and protect DNA[J].Im J Pharm,1999,178(2)：231-243．

[4] 曾萍,彭明利,徐溢.PLGA微粒/納米粒基因載體的研究進展[J].藥學學報,2010,45(11):1346-1353.

[5] 方琴,王季石,許紅瑋,等.紫杉醇mPEG2PLGA納米粒的制備及其抗腫瘤作用研究[J].中國藥學雜志,2007,42(19):1483-1486.

[6] 王剛,潘麗,張永光.PLGA納米/微球作為核酸載體的研究進展[J].微生物學通報, 2009,36(12):190-198.