應用脂肪干細胞構建小口徑組織工程血管平滑肌層的實驗研究

崔 磊，雷萬軍，楊建英

血管組織的缺損是臨床上常見的外科疾病之一。目前臨床上大多采用自體移植、異體移植以及人工合成替代品移植技術來修復這些缺損，但這些方法各有其缺點，很難滿足臨床上血管缺損修復的需要[1-2]。組織工程學的產生為血管病變的修復提供了一種新的途徑。由于脂肪干細胞(adipose derived stem cell，ASCs)具有來源廣泛、取材方便、對供體損傷小、體外增殖能力強且不受年齡的影響等特點[3-4]，而備受人們的關注，用作組織工程血管構建的種子細胞。同時，我們的前期實驗也證明，在應用能模擬體內血流循環、血管搏動的裝置—血管生物反應器的作用下，可以產生具有一定力學強度的組織工程化血管平滑肌層[5-6]。本實驗就在此研究的基礎上，應用人ASCs作為種子細胞，在轉化生長因子(TGF-β1)和骨形態發生蛋白4(BMP4)的作用下，向平滑肌細胞誘導分化，并應用生物反應器在體外構建組織工程化血管組織。

1 材料和方法

1.1人脂肪干細胞(hASC)的分離、培養脂肪組織來源于上海第九人民醫院整復外科脂肪抽吸術患者，均為女性，平均年齡30歲。根據Zuk[7]的方法進行，簡言之：無菌PBS沖洗脂肪，用0.075%I型膠原酶(Sigma-Aldrich)在37℃搖床中消化60 min后，加同體積含10%FBS (Gibco公司)的低糖DMEM培養液終止消化，1 200 g離心10 min，小心吸除上層脂肪油層和大部分上清，50 μm濾網過濾離心成分，再600 g離心10 min，去除上清，用含10%FBS的LG-DMEM培養液重懸細胞，以4.0×104細胞/cm2接種于直徑100 mm培養皿中，24 h后去除非貼壁細胞，之后每隔3 d換液，細胞達80%～90%融合時，常規傳代，第4～6代的細胞用于以下實驗。

1.2人脂肪干細胞(hASC)向平滑肌細胞的誘導分化當hASCs達50%～60%融合時，分不同組加入如下不同的培養液進行誘導觀察：①LG-DMEM+10%FBS(正常培養液)， ②LG-DMEM+1%FBS(BM)，③LG-DMEM+1%FBS+5 ng/mlTGF-β1(R&DSystems)，④LG-DMEM+1%FBS+2.5 ng/mL BMP4(R&DSystems)，⑤LG-DMEM+1%FBS+2.5 ng/mLBMP4+5 ng/mLTGF-β1。人臍動脈平滑肌細胞(hUASMCs)作為陽性對照。每2 d換液1次，共誘導7 d。

1.3細胞生長曲線的檢測將在上述不同培養液中的細胞分1、3、5、7和10 d 5個時間點以DNA定量的方法進行計數。即以0.5 mg/mL的蛋白酶K溶解消化細胞，每孔0.5 mL，56℃過夜。離心(1 200 r/min)后洗去40 μL上清與160 μL Hoechst33258染液混合，移入黑色平底96孔板中，避光37℃孵化20 min，以全波段酶標儀檢測360 nm熒光強度(激發光波長465 nm)。并以相同方法檢測確定細胞數的DNA的360 nm熒光強度，繪制標準曲線，根據標準曲線和檢測熒光值得出所測樣本的細胞數。

1.4免疫熒光檢測用乙醇∶冰醋酸(99∶1)固定細胞或組織切片15min，PBS漂洗；10%羊血清封閉30 min；加適當稀釋的一抗：鼠單克隆抗α-SMA(Sigma-Aldrich)、SM-MHC (Sigma-Aldrich)，兔多克隆抗SM22α (Abcam)和兔單克隆抗calponin (Abcam)， 4℃過夜；PBS漂洗，滴加FITC標記的相應二抗，37℃孵育45 min，PBS漂洗；碘化丙啶(PI)襯核后，熒光顯微鏡下觀察。以臍動脈平滑肌細胞為陽性對照。

1.5 RT-PCR檢測用Trizol提取不同條件下誘導7 d的細胞內總RNA，進行逆轉錄反應，然后進行PCR擴增檢測平滑肌特異性標記物α-SMA、SM22α、calponin和SM-MHC的表達，反應條件：95℃ 3 min變性，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s，35個循環，72℃延伸10 min。引物序列如表1。

表1 RT-PCR反應引物序列

1.6 Western-blotting檢測用細胞裂解緩沖液裂解細胞或組織，獲取蛋白，將蛋白與2×上樣緩沖液混合后，SDS-PAGE電泳，然后轉移至PVDF膜上，將印跡后的PVDF膜用甲醇浸泡，加入封閉液(5%BSA，TBST),4°C封閉過夜。各一抗和β-actin加入膜上，4℃過夜，吸去一抗，加入IRDye 700 DX或IRDye 800 CW標記的二抗，以Odyssey紅外圖像成像系統掃描成像，β-actin的表達作為各組細胞的內參。

1.7 PGA膜片的制備及細胞-PGA復合物的體外培養將50 mg未編織的PGA纖維制作成55 mm×45 mm×2 mm大小的膜片，75%乙醇浸泡1 h ，紫外光照射30 min，用標準DMEM液浸泡過夜。收集hASCs 5×107細胞/mL，將1mL的細胞懸液接種于PGA材料上，置于37℃、5%CO2培養箱內，黏附4 h后加入誘導液，體外培養皿中培養7 d，取細胞-PGA復合物同時做掃描電鏡觀察和DiO標記細胞后的激光共聚焦顯微鏡觀察細胞在材料上的黏附情況。

1.8細胞-PGA復合物在生物反應器內的動態培養1周后，將細胞-PGA復合物卷裹于反應器反應槽內的無菌硅膠管上(內徑4 mm)，并用無菌可吸收縫線固定。動態組：將其接于動態槽內接口，予以動態力學刺激，參數設定為：搏動頻率75次/min，擴張量<5%，流量為70～80 mL/min至100～120 mL/min，壓力為0.01～0.02 mPa。每周換液1次，共培養8周。

1.9組織學檢測常規石蠟切片，分別做H&E染色、Masson三色染色和Gomori醛復紅染色觀察新生管樣組織的組織學特點、膠原分泌情況和彈性纖維的合成情況。

1.10生物力學檢測用INSTRON力學測定儀對構建的組織的最大張力、彈性模量和縫線張力進行測定。

1.11組織工程化血管膠原含量的測定將構建的組織稱重，并用10∶1比例的胃蛋白酶進行消化，振蕩過夜，根據Sircol Soluble Collagen Assay試劑盒，用分光光度儀測量540 nm處的光密度值，根據標準曲線測定測定組織中總膠原的含量，用μg/g 濕重表示。

1.12統計學分析所有結果均采用均數±標準差表示，采用SPSS 11.0統計軟件(Student’st檢驗)進行統計學分析，當P<0.05 時，具有統計學意義。

2 結果

2.1細胞形態觀察hASC在正常培養液培養下細胞呈成纖維樣梭形生長(圖1a)，在單純低血清培養液(BM)中呈扁平樣生長(圖1b)，而在含有TGF-β1和/或BMP4的誘導液的作用下，細胞呈梭形生長，與hUASMCs的生長形態相似，呈平滑肌細胞特有的“波峰—波谷”樣生長模式(圖1c～f)。其中尤其在TGF-β1和BMP4的聯合誘導作用下細胞形態變化更明顯，Phalloidin 染色(圖1)也顯示了細胞內的肌絲與hUASMCs一致。

a:正常培養液中第5代hASCs的生長形態 b:無生長因子的低血清培養液培養7 d c:單純TGF-β1誘導組 d:單純BMP4誘導組 e:TGF-β1和BMP4聯合誘導組 f:陽性對照hUASMCs組(標尺大小：a～f：100 μm,其中插圖標尺大小：50 μm)。

2.2細胞生長曲線從圖2的生長曲線可以看出，hASCs在正常培養液中持續生長，而在其他組，無論是單純的低血清誘導組還是加有生長因子的誘導組，細胞都出現了生長停滯，說明hASCs的生長活性良好。同時，在加有生長因子的情況下，細胞生長停滯有利于細胞向平滑肌細胞分化。

2.3 hASCs在TGF-β1和BMP4的作用下平滑肌細胞特異性標記物的表達免疫熒光檢測可以看出，hASCs在TGF-β1和BMP4的聯合誘導作用下，表達平滑肌細胞的特異性蛋白：α-SMA、SM22α、calponin和SM-MHC。而在正常培養液組盡管可見α-SMA、SM22α的基礎表達，但在生長因子的作用下，這兩個標記物的表達有明顯的提高，且只有在聯合誘導下，才有SM-MHC的表達，這一標記物只在平滑肌細胞中表達，從而證明在TGF-β1和BMP4的聯合作用下，hASCs分化成平滑肌樣細胞(圖3)。為了證明免疫熒光染色的結果，我們做了western-blot來觀察上述指標在蛋白水平的表達情況，從圖4A 可以看出，α-SMA、SM22α在正常培養液和單純低血清組也有一定的表達，但只有在TGF-β1和BMP4的聯合誘導組，這些特異性蛋白的表達才與陽性對照組相當。這與熒光觀察的結果一樣。同時，為了進一步證明TGF-β1和BMP4對hASCs的誘導分化作用，我們又做了RT-PCR來檢測這些平滑肌細胞相關基因在轉錄水平的表達情況。從圖4B可以看出，未分化的hASCs 只表達低水平的α-SMA、SM22α mRNA、TGF-β1或BMP4，單純誘導組可見calponin的表達，而只有兩者聯合作用組才見SM-MHC的表達且與陽性對照組相似。從而在蛋白和轉錄水平證明了在TGF-β1和BMP4的聯合作用下，hASCs分化成了平滑肌細胞。

A:不同組細胞生長的形態變化 B:DNA定量法(Hoechst 33258染色)檢測hASCs在不同培養液中的增殖曲線

可見只有在TGF-β1和BMP4的聯合誘導作用下，誘導細胞才表達與hUASMCS相似的細胞骨架蛋白(綠色)，PI襯細胞核(紅色)。標尺大小：25 μm，插圖：50 μm。

圖3 免疫熒光染色觀察hASCs在不同培養條件下作用7 d表達平滑肌細胞特異性蛋白(α-SMA、SM22α、calponin和SM-MHC)的情況

A:Western-blot分析α-SMA, SM22α、Calponin、SM-MHC和β-actin的表達 B:RT-PCR觀察各蛋白的mRNA的表達

2.4細胞-PGA復合物的體外及生物反應器內培養細胞-PGA復合物在體外培養7 d，電鏡和激光共聚焦可見大量細胞黏附于材料上，并有大量的細胞外基質分泌充填于PGA纖維間，且細胞分布于PGA膜片的各個部位 (圖5a～d)。隨著復合物在反應器內的培養，PGA材料逐漸降解，形成管樣組織(圖5e)。培養8周后，形成新生的組織工程化肌管組織。新生組織色澤光亮，質地均勻，管腔圓潤，具有一定的彈性和強度(圖5f)。

2.5組織學觀察反應器內培養8周后，HE染色可見構建組織結構致密，平滑肌纖維排列規則，分布較均勻，PGA纖維已基本降解。Masson染色可見膠原分泌旺盛且濃密，肌纖維排列整齊，細胞分布規則，PGA已降解完全。但是未見彈性纖維的結構出現(圖6A)。同時我們對構建的組織進行免疫組化分析，可以看出細胞在反應器內培養8周后仍然表達平滑肌細胞的標記物，細胞分布均勻規則(圖6B)。

a:PGA支架材料大體觀 b:掃描電鏡觀察7 d時，PGA材料上有大量細胞黏附并伴細胞外基質分泌，箭頭指示分泌的基質。插圖示倒置相差顯微鏡觀察7 d時細胞-PGA復合物，細胞材料黏附緊密，細胞外基質分泌增多 c:DiO標記的細胞接種至PGA支架材料上7 d的黏附情況 d:激光掃描共聚焦顯微鏡觀察有大量DiO標記的平滑肌樣細胞分布于PGA纖維上，且有豐富的細胞外基質分泌其中，插圖示橫斷面情況 e～f:隨著細胞-PGA復合物在反應器內的培養，PGA逐漸降解，形成管樣組織

2.6膠原定量和生物力學檢測反應器內培養8周構建組織的膠原含量達(48.4±6.65) μg/g濕重，而正常的人大隱靜脈的膠原含量為(78.15±5.57)μg/g濕重，達到正常血管的60%。將構建的組織沿環狀面切開，根據應力—應變曲線可以看出：反應器內力學動態培養構建組織的最大張力達0.63×106Pa，達到了正常人大隱靜脈的65%。8周后，構建組織的縫線張力達(0.93±0.04) N，達到正常大隱靜脈的56%(表2)。以上結果說明在生物反應器內力學刺激的培養下，所構建的管樣組織力學強度達到了正常大隱靜脈的近60%。

3 討論

隨著自體血管移植技術的發展，尤其是人工合成血管(如Dacron、ePTFE等)制備技術的不斷提升，使臨床修復直徑大于6 mm血管的成功率大大提高。但是對于直徑小于6 mm的小口徑血管由于缺乏內皮覆蓋,易發生血栓，造成血管堵塞。組織工程技術的出現為解決小口徑血管重建的難題提供了可能。但由于種子細胞來源不足而造成其很難很快進入臨床應用。本實驗證明在TGF-β1和BMP4的聯合誘導作用下，hASCs獲得了平滑肌細胞的形態，并且表達平滑肌細胞的特異性標記物α-SMA、SM22α、calponin和SM-MHC。同時我們的前期試驗還表明誘導后的細胞接種于膠原凝膠上出現和正常成熟平滑肌細胞一樣的收縮反應。說明hASCs可作為種子細胞用于構建組織工程化血管。

A:構建組織(a、c、e)和人臍動脈(b、d、f)，其中a～b為H&E染色，c～d為Masson三色染色，e～f為Gomori醛復紅染色。箭頭示彈性纖維，標尺長度：100 μm B:免疫組化檢測反應器內培養培養8周的組織表達α-SMA和calponin的情況，標尺長度：50 μm

為了使構建的組織獲得理想的力學強度，必須使接種的材料有合適的降解速率，本實驗使用PGA作為支架材料，因為它具有良好的生物相容性，Niklason等[8]就是應用PGA構建了第一個自體血管移植物并回植體內的。同時，我們也在前期研究中應用PGA和成熟平滑肌細胞成功構建了大口徑血管壁組織。但是，本實驗應用的PGA膜片支架是手工編織的，容易造成PGA纖維的分布不均，從而造成細胞分布不均，構建的組織薄厚不均，影響最終的力學強度。因此，有待改進技術以提高PGA膜片支架的一致性、均一性。

研究表明循環張力可以明顯提高構建血管組織的力學強度，降低細胞的程序性死亡[9]，促進細胞的定向排布，增加膠原含量，防止平滑肌細胞的表型改變[10]，從而增加平滑肌細胞的收縮特性。本實驗的結果顯示，在生物反應器內動態刺激下所構建的組織工程化平滑肌層組織學結構層次清晰，結構致密，膠原含量明顯增加，同時，在動態力學的刺激下，新生組織細胞分布有序，膠原濃密，排列規則。說明適宜的力學刺激有利于血管組織的形成和細胞適應性再塑。這一觀察結果與Seliktar的報道[11]相一致，他們認為循環張力通過過度表達金屬蛋白酶-2以提高基質的重塑。同時我們觀察到，誘導的hASCs在沒有生長因子的作用下在生物反應器內動態培養8周仍能維持平滑肌細胞的表型。

表2 構建組織的生物力學檢測結果，與人大隱靜脈(HSV)作比較

本實驗中應用的生物反應器，主要模擬了血管承受的雙軸張力，即細胞橫斷面上的同向張力和軸向張力。而對于血管承受的流體剪切應力，即流動的血液順血流方向作用于腔側血管內皮細胞單位面積上的力，尚無法模擬。因此，應進一步完善生物反應器的結構，使之能模擬立體剪切應力作用，以使之能更完全模擬體內流體作用的環境。

血管的生長發育是一個緩慢而復雜的過程，其生物力學性能也是隨著血管的不斷生長在血流的不斷作用下而逐漸提高的，體外生物反應器只是給予細胞—生物材料一個更接近的生長環境，其最終的目的是要回植到體內，用于血管缺損的修復。而體內的大環境才是血管生長成熟的最佳環境，體內的血流刺激才是最有效的作用因素。下一步可考慮接種上內皮細胞，回植體內，在血流的作用下，使其進一步生長發育。從而構建出更符合生理功能的血管組織。

本實驗結果表明hASCs在TGF-β1和BMP4的作用下可誘導分化為平滑肌細胞，并且誘導的細胞可在三維PGA支架上保持平滑肌細胞的表型。同時將其接種于PGA支架材料上，可在生物反應器內形成具有一定強度的小口徑血管組織(內徑4 mm)。另外此方法還可以用以構建其他小口徑的肌管組織如輸尿管、膽囊管和卵巢管等。

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