超氧化物歧化酶(Val16Ala)基因的克隆及其真核表達載體的構建

王 華，王九輝，譚光宏

(海南醫學院海南省熱帶病重點實驗室，海南 海口 571199)

·論 著·

超氧化物歧化酶(Val16Ala)基因的克隆及其真核表達載體的構建

王 華，王九輝*，譚光宏

(海南醫學院海南省熱帶病重點實驗室，海南 海口 571199)

目的 獲得錳超氧化物歧化酶(MnSOD)基因并進行Val16Ala(GTT→GCT)位點的定點突變，構建MnSOD(Val)及MnSOD(Ala)基因的真核表達載體。方法 采用RT-PCR法從人乳腺癌細胞MCF-7中擴增MnSOD(Val)基因；PCR引物延伸法對Val16Ala進行定點突變以獲得MnSOD(Ala)基因；通過EcoRⅠ+XhoⅠ雙酶切PCR產物與相應質粒pEGFP-N1連接構建兩基因的真核表達載體pEGFP-N1-MnSOD(Val)和pEGFP-N1-MnSOD(Ala)。結果 突變位點經測序證明正確，重組質粒經雙酶切及測序鑒定證明正確。結論 本實驗成功獲得了MnSOD(Val)及MnSOD(Ala)基因并成功構建了兩基因的真核表達載體。

MCF-7；MnSOD；Val16Ala；真核表達載體

錳超氧化物歧化酶(MnSOD)是位于線粒體內的抗氧化酶，通過調節體內ROS水平影響乳腺癌的進展及多種抗癌藥物的效應。MnSOD的Val16Ala基因多態性具有功能性改變且發生頻率高，與乳腺癌的發生及預后相關。為了分析Val及Ala兩等位基因過表達后對乳腺癌細胞MCF-7功能及基因表達的差異以及化療藥物敏感性的差異，本研究在獲得MnSOD基因野生型的基礎上，首先對MnSOD基因進行第16位氨基酸的點突變，即GTT突變為GCT，然后構建了MnSOD(Val)及MnSOD(Ala)基因的真核表達載體，以期為進一步研究Val16Ala多態性對乳腺癌進展及化療敏感性的影響打下堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株與質粒 人乳腺癌細胞MCF-7購自中國典型培養物保藏中心。攜帶EGFP基因的真核表達質粒pEGFP-N1為本實驗室保存。

1.1.2 藥品與試劑 細胞培養用DMEM及胎牛血清FBS購自GIBCO公司，0.25%胰蛋白酶購自AMESCO公司；RNA提取試劑TRIzol購自Invitrogen公司，AMV逆轉錄酶購自Promega公司；ExTaq、T4DNA連接酶、EcoRⅠ、XhoⅠ及DL2000DNA Marker均購自TAKARA公司；所用引物根據GeneBank中序列號為NM_000636的cDNA序列(669bp)設計并均由上海生工合成；PCR產物純化試劑盒QIAquick PCR Purification Kit、膠回收試劑盒MinElute Reaction Cleanup Kit均購自QIAGEN公司。DNA Ladder購自碧云天生物技術研究所。所用化學試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 DMEM培養液含10%FBS，于37℃、5%CO2培養箱中培養，待細胞融合至80%，用于后續實驗。

1.2.2 RT-PCR 采用TRIzol裂解細胞，提取細胞總RNA，兩步法擴增MnSOD cDNA全長基因。首先，逆轉錄按20μL體系進行。體系中含RNA樣品11μL、Oligo dT(18)2μmol/L，于65℃保溫5min，然后冰浴5min；隨后往上述體系中依次加入RNase抑制劑(40U/μL)0.5μL、10×AMV 反應緩沖液 2μL、dNTP(10μmol/L)2.5μL及AMV逆轉錄酶2μL，輕輕混勻后于42℃水浴1h，再于70℃水浴15min終止反應，產物存于-20℃。擴增MnSOD cDNA全長基因所用引物為P1(TCAGAT CTCGAG ATGTTGAGCCGGGCAGTGT，1～19bp)、P2(CTGCAGAATTC CTTTTTGCAAGCCATGTATC，647～666bp)。擴增條件：95℃預變性5min；94℃ 40s，51℃ 1min，72℃ 1min，30個循環；72℃延伸5min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。此時獲得的基因型為MnSOD(Val)。

1.2.3 Val16Ala點突變 Val16Ala點突變即為編碼Val的密碼子GTT點突變為編碼Ala的密碼子GCT。以上述MnSOD(Val)基因RT-PCR產物純化后為模板，P4(CAGC AGGCAGCTGG CTCCGGCTTTGGG，27～53bp，紅色標記處為突變位點)與P2為引物做PCR，對MnSOD(Val)基因進行點突變；第一次PCR產物純化后作為模板，以P3(CC GGGCAGTGTG CGGCACCAGC AGGCAG，8～36bp)與P2為引物做PCR，即延伸反應；再將第二次PCR產物純化后作為模板，P1與P2為引物做第二次延伸反應，以獲得全長的MnSOD(Val16Ala)點突變序列。PCR擴增條件為：94℃預變性4min；94℃ 40s，55℃ 1min，72℃1min，28個循環；72℃延伸6min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。此時獲得的基因型為MnSOD(Ala)。

1.2.4 載體構建 取上述純化的PCR產物[Mn-SOD(Val)、MnSOD(Ala)]，分別用EcoRⅠ+XhoⅠ雙酶切，并同時雙酶切真核表達質粒pEGFP-N1。酶切產物切膠回收后于16℃連接過夜，連接產物經CaCl2法轉化宿主菌NovaBlue，并以卡那霉素作為抗性篩選標記。堿裂解法小量提取質粒并用EcoRⅠ+XhoⅠ雙酶切鑒定陽性轉化子。本試驗中所有DNA重組操作均按《分子克隆試驗指南》第3版[1]的方法進行。

1.2.5 突變位點的鑒定 取上述實驗篩選出來的陽性克隆樣品菌液，送測序，測序引物為GGAGGTCTATATAAG(該序列位于質粒多克隆位點上游部分)。

2 結 果

2.1 電泳結果 MnSOD(Val)、MnSOD(Ala)基因的獲得PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖1，所得產物在669bp處，符合實驗預期。

圖1MnSOD基因PCR擴增結果

2.2 真核表達載體的構建 MnSOD(Val)、Mn-SOD(Ala)型基因分別與載體pEGFP-N1連接、轉化，EcoRⅠ+XhoⅠ雙酶切鑒定陽性轉化子。鑒定結果如圖2所示：已獲得兩種基因型的重組質粒。

圖2 重組質粒的EcoRⅠ+XhoⅠ雙酶切鑒定結果

2.3 突變位點的鑒定 取上述結果中1號樣品與6號樣品菌液送測序，測序結果經生物學軟件DNAMAN比對以檢查其突變位點。比對結果見圖3，Mn-SOD(Ala)基因型中的GTT已經成功突變為GCT，符合實驗預期。測序結果也證明了載體構建是正確的。

圖3DNAMAN比對結果

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其風險因素包括年齡、家族史、生育、月經史以及肥胖等。近年來發現錳超氧化物歧化酶(MnSOD)基因的Val16Ala多態性與乳腺癌的發生及預后具有相關性。MnSOD在線粒體內發揮對氧自由基的清除作用，是一種非常重要的抗氧化酶。該基因敲除的小鼠表現出線粒體的功能紊亂，并產生致命后果，相反，過表達MnSOD則對線粒體有保護作用[2]。MnSOD基因的Val16Ala多態性位于信號肽的第16位氨基酸處，其在將Mn-SOD靶向定位于線粒體中起關鍵作用。信號肽16位氨基酸為Ala時線粒體中的MnSOD含量明顯高于Val存在時的含量[3]。

有研究表明，乳腺癌的進展與體內ROS和抗氧化系統的平衡失調有關[4]。ROS是一種重要的信號分子，可調節細胞的分化、增殖、轉化及凋亡，但過高的ROS可對細胞產生毒性作用[5]。MnSOD通過調節線粒體內的ROS水平，防止細胞收到氧化壓力的損傷，從而對腫瘤的病理生理過程產生影響。另外，MnSOD表達水平的變化還可導致抗癌藥物療效及不良反應的差異。例如，抑制MnSOD表達可提高卵巢癌細胞對阿霉素和紫杉醇的敏感性；阿霉素與重組MnSOD聯合用藥可提高對乳腺癌細胞和小鼠實體瘤的療效；MnSOD水平升高可使消化道腫瘤細胞對阿霉素和絲裂霉素C的敏感性下降；MnSOD對阿霉素的心臟毒性具有保護作用等[6-9]。因此，明確MnSOD基因的Val16Ala多態性對乳腺癌進展及化療敏感性的影響意義重大。本研究在成功獲得突變體的基礎上構建了MnSOD(Val)及MnSOD(Ala)基因的真核表達載體pEGFP-N1-MnSOD(Val)和pEGFP-N1-Mn-SOD(Ala)，以期在MCF-7細胞中穩定表達后為進一步研究Val16Ala多態性對乳腺癌進展及化療敏感性的影響打下堅實的基礎。

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Cloning of manganese superoxide dismutase gene(Val16Ala)and the construction of its eukaryotic expression vector.

WANG Hua,WANG Jiu-hui*,TAN Guang-hong.Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Medicine,HainanMedical University,Haikou 571199,Hainan,CHINA

Objective To clone manganese superoxide dismutase gene(MnSOD)and the site-directed mutation for Val16Ala(GTT→GCT),then construct eukaryotic effective expression vector with the two genotypes.Methods Firstly,we cloned gene MnSOD(Val)from the total RNA of human breast carcinoma cells MCF-7by RT-PCR and the site-directed mutated mutation for Val16Ala(GTT→GCT)by overlap extension using PCR to acquire genotype MnSOD(Ala).Secondly,the two genotypes digested byEcoRⅠ andXhoⅠ,and then ligated to expression vector pEGFP-N1to construct the plasmid pEGFP-N1-MnSOD(Val)and pEGFP-N1-MnSOD(Ala).Results Mutation site were proved correctly by sequencing,and the recombinant vectors were proved to contain the expected inserts by double digestion with restriction enzymes and sequencing.Conclusion Two genotypes MnSOD(Val)and MnSOD(Ala)have been cloned,and two eukaryotic expression vectors containing the two genes have been constructed successfully.

MCF-7;MnSOD;Val16Ala;Eukaryotic expression vectors

R394

A

1003—6350（2012）16—001—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.16.001

國家自然科學基金(編號：81060276)

王 華(1980—)，女，重慶市人，助理研究員，碩士。*

王九輝，副教授。E-mail：wangjh3@tom.com

2012-05-08)