乳腺癌基因治療的研究進展

杜力成，王 棟(綜述)，劉 奇※，田興松(審校)

(山東大學附屬省立醫院1乳腺甲狀腺外科，2胸外科，濟南250021)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。基因治療是繼手術、放化療以及內分泌治療之后的一種新興治療手段，與傳統的治療模式相比，有更好的靶向性、針對性，更適于對乳癌患者實施個體化治療。近年來，隨著對腫瘤分子病理學認識的不斷深入，乳腺癌的基因治療研究快速發展，某些靶向藥物已成功應用于臨床并取得了良好的效果。現就乳腺癌基因治療的相關情況予以綜述。

1 自殺基因治療

自殺基因是指能將無毒的藥物前體轉化為細胞毒性物質的基因。轉入自殺基因的腫瘤細胞可以被前藥的有毒代謝產物選擇性破壞。旁觀者效應是另一作用機制，是指除了破壞那些整合了自殺基因的腫瘤細胞外，自殺基因對鄰近的未被轉染的腫瘤細胞也有破壞作用，從而大大提高了該治療對腫瘤細胞的殺傷能力［1］。

單純皰疹病毒胸苷激酶基因(herpes simplex virus thymidine kinase，HSV-tk)/更昔洛韋(ganciclovir，GCV)或阿昔洛韋(acyclovir，ACV)是研究最多的自殺基因系統。GCV/ACV通過HSV-tk的磷酸化作用變為磷酸鹽形式，抑制腫瘤細胞內DNA多聚酶活性，靶向干擾轉導細胞的生長。Sacco等［2］建立了轉雙基因小鼠(neu/HSV-tk)及轉單基因小鼠(neu)并進行乳腺癌成瘤實驗，之后用GCV進行瘤內注射，結果顯示，GCV治療對轉雙基因小鼠的腫瘤生長速度有抑制作用，而對轉單基因小鼠的腫瘤生長無影響，證實了HSV-tk處理可以激活乳腺癌細胞對GCV的敏感性。Shibata等［3］用電穿孔法轉染HSV-tk基因并加用GCV干預，進一步證實HSV-tk/GCV治療可以抑制乳腺癌生長，降低淋巴結轉移和肺轉移率，誘導腫瘤細胞凋亡。

此后，越來越多的自殺基因系統被發現并應用于科研及臨床治療。AQ4N(banoxantrone)是一種新近發現的無毒藥物前體，在乏氧的腫瘤組織中可以激活為細胞毒素AQ4，抑制腫瘤細胞拓撲異構酶的活性。Albertella等［4］對32例惡性腫瘤患者(包括6例乳腺癌患者)靜脈應用200 mg/m2劑量AQ4N，之后檢測藥物濃度，發現高濃度的AQ4選擇性地聚集在腫瘤組織中，而在正常組織中含量極低，提示AQ4N是一種較為安全的自殺基因治療前藥。

2 癌基因拮抗治療

癌基因拮抗治療可通過抑制原癌基因功能和恢復抑癌基因功能兩種途徑實現。惡性腫瘤是由于原癌基因異常激活導致的基因疾病，通過抑制癌基因的表達及其產物的生物學活性可以達到治療腫瘤的目的。目前研究最多的乳腺癌基因是人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)基因。HER-2基因又稱c-erbB-2基因，其擴增及過表達與乳腺癌的發生、早期轉移及對激素或非蒽環類藥物耐藥性有關。Herceptin(赫賽汀)是重組的抗HER-2受體的單克隆抗體，已于1998年由美國食品藥品管理局批準上市［5］。Herceptin可用于HER-2基因陽性表達的乳腺癌患者，單藥有效率達35%。與化療藥物，如長春瑞賓、紫杉醇等聯合應用，可以提高治療的有效率，延長患者生存時間［6］。Herceptin作為一種靶向性基因治療藥物，針對性殺傷HER-2基因陽性的惡性腫瘤細胞，而不影響正常細胞的生存，為HER-2陽性乳腺癌患者提供了較為安全可靠的臨床治療方法，是目前較為成功的靶向抗癌治療研究范例。除了抑制原癌基因的激活和表達，癌基因拮抗治療還包括重建抑癌基因的功能。p53基因是研究最多和較為深入的一種抑癌基因。野生型p53蛋白充當“分子警察”，使有癌變傾向的細胞消亡。突變的p53基因不僅引起p53抑癌活性的丟失，還促進細胞惡性轉化，從而由抑癌基因轉化為癌基因。在癌癥患者中，半數以上存在p53基因突變，而在乳腺癌患者中，則有20%～35%可以檢測到p53突變體［7-8］。p53基因的異常表達與乳腺癌發生、復發和預后不良有關［9］。Dummer等［10］對乳腺癌患者進行了p53基因治療的Ⅰ期臨床試驗，發現以腺病毒載體攜帶野生型p53基因導入人乳腺癌組織后引發了人體的抗瘤效應。美國安德森癌癥中心對重組p53-腺病毒制品advexin進行了乳腺癌治療的臨床試驗，觀察advexin與兩種化療藥物(多西他賽、阿霉素)聯合使用對局部晚期乳腺癌的療效。經過4個月的臨床試驗，90%的患者出現腫瘤完全消退或部分消退［11-12］。

BRCA-1是另一種與乳腺癌有密切關系的抑癌基因。在家族性乳腺癌的患者中，BRCA-1基因缺陷率高達90%［9］。這類患者也常伴有p53基因突變。根據上述理論，Liu等［13］構建了一種BRCA-1基因缺陷的動物模型，該模型同時含有BRCA-1和p53基因的突變，其分子生物學特性與人類BRCA-1基因缺陷的遺傳性乳腺癌類似，表現出增殖快、分化低、ER(－)等一系列特點及很強的遺傳不穩定性，驗證了BRCA-1基因缺陷在人類乳腺癌發病過程中的作用，提示BRCA-1基因靶向治療有望成為乳腺癌治療的有效方法［14-15］。

3 抗血管生成治療

新生血管生成是惡性腫瘤生長和轉移的重要機制，研究發現，直徑2～3 mm以上的實體腫瘤必須依靠新生血管的供養才能繼續生長。血管發生與很多生物因子，如血管生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、成纖維細胞生長因子、轉化生長因子α和β等密切相關。

VEGF是迄今發現的活性最強的血管生長調節因子，腫瘤細胞及內皮細胞通過分泌VEGF促進內皮細胞的分裂、增殖及遷移，增強血管透性，是目前研究最多的抗新生血管治療分子靶。使用抗VEGF配體/受體的抗體或VEGF受體抑制劑理論上都可以達到治療目的。Wilmes等［16］應用 VEGF受體酪氨酸激酶抑制劑AG-013736對接種乳腺癌的裸鼠進行治療，7 d后用動態增強磁共振成像觀察療效，并進行病理學分析。結果發現，治療組腫瘤生長明顯受到抑制，腫瘤微血管密度明顯減少，血管通透性明顯降低，壞死及死亡細胞數增加。

貝伐單抗是重組的人VEGF的單克隆抗體，通過特異性結合VEGF配體、阻止其與受體結合而發揮抗癌作用，是第一種基于抗血管生成理論研發的惡性腫瘤治療藥物。Wedam等［17］用貝伐單抗對21例晚期乳腺癌患者進行治療，并進行分子生物學分析，發現貝伐單抗治療可以抑制VEGF受體活性、內皮細胞增殖以及血管通透性，誘導腫瘤細胞凋亡。

4 基因免疫治療

基因免疫治療的目的是在基因水平刺激宿主的免疫系統產生抗腫瘤免疫。其主要策略是通過基因重組技術，導入細胞因子基因以提高機體抗瘤能力，或通過表達腫瘤細胞缺乏的某些分子以增強腫瘤細胞的免疫原性，激發機體免疫反應和(或)增強機體針對腫瘤相關抗原(tumor-associated antigen，TAA)的特異性免疫。

近來有報道利用樹突狀細胞(dendritic cell，DC)的高抗原呈遞性，將腫瘤抗原的編碼基因轉染DC，DC持續表達并呈遞腫瘤抗原，誘導機體產生CD4+和CD8

+T細胞特異性的抗腫瘤免疫應答。Wang等［18］將攜帶多種TAA的慢病毒載體(lentiviral vector，LV)修飾DC細胞并對荷瘤鼠進行免疫，發現該腫瘤疫苗(LV-TAA-DC)具有強抑瘤作用，治療后實驗組小鼠體內干擾素γ水平增高，細胞毒性T細胞效應增強，小鼠生存時間延長。同理，也可以將抗腫瘤免疫相關細胞因子的基因轉入DC細胞，從而增強機體抗腫瘤免疫，達到治療目的。Bontkes等［19］將TAA和白細胞介素12的mRNA共轉染入DC細胞，發現該腫瘤疫苗能夠誘導自然殺傷細胞和細胞毒性T細胞介導的腫瘤免疫應答。

5 溶瘤病毒治療

溶瘤病毒治療原理是通過對自然界存在的一些致病力較弱的病毒進行基因改造制成特殊的溶瘤病毒，利用靶細胞中抑癌基因的失活或缺陷從而選擇性地感染腫瘤細胞，在其內大量復制并最終摧毀腫瘤細胞。在腫瘤細胞溶脹死亡后釋放出的病毒可繼續感染其他腫瘤細胞，同時這些病毒因無法在正常機體細胞內復制而不具有殺傷作用。因而，理論上溶瘤病毒治療具有較高的效率和較低的不良反應。

ONYX-015是一種缺失編碼區E1B-55 kd的腺病毒突變株，野生型p53基因可與該段編碼區E1B-55 kd特異性結合，從而阻止ONYX-015基因轉錄。ONYX-015只能選擇性地在p53基因缺陷的腫瘤細胞內復制并破壞該細胞，對于正常細胞無影響。目前，對溶瘤病毒ONYX-015的腫瘤治療的研究多集中在頭頸部腫瘤。2002年，Kenzer等［20］對 ONYX-015治療乳腺癌進行了初步研究，選擇5例乳腺癌胸壁復發瘤患者進行病灶局部注射并觀察，結果發現2例患者出現腫瘤細胞內腺病毒感染，其中1例腫瘤組織內出現壞死，而在正常細胞內未發現病毒感染征象。多個臨床試驗均顯示溶瘤病毒具有良好的治療效果，與放化療結合應用時抗瘤效應增強，該治療手段耐受性良好，毒性低，不良反應較少［21-23］。

6 反義基因治療及RNA干擾技術

反義基因治療是以反義寡核苷酸或表達反義mRNA的載體導入細胞以校正基因表達異常。由于反義治療的靶向為特定序列，特異性高，不良反應少。Suzuki等［24］設計了抗乳腺癌 HER-2基因的核酶，并重組入腺病毒載體，對荷瘤裸鼠進行注射，結果發現該制劑明顯抑制了乳腺癌組織的生長。

RNA干擾是在反義基因研究中意外獲得的重大科學突破，由此而衍生的RNA干擾技術已發展成為一種全新的基因阻斷技術，并成為乳腺癌基因治療的研究熱點。Hu等［25］應用攜帶 HER-2基因干擾RNA的質粒載體(HER2-shRNAs)對乳腺癌細胞株的體外生長及體內成瘤作用進行干預，發現HER2-shRNAs能夠降低HER-2基因在mRNA和蛋白水平的表達量，抑制腫瘤細胞增殖，增加腫瘤細胞凋亡，并抑制實驗鼠種植瘤的生長，與表柔比星聯合使用具有協同作用。

7 其他抗乳腺癌基因治療策略

近年來多種其他基因治療策略也被成功地用于乳腺癌基因治療的實驗研究中，如導入二氫葉酸還原酶基因以耐受甲氨蝶呤的化療，或導入多藥耐藥基因以耐受多種化療劑等;將凋亡相關基因(如Fas基因等)導入腫瘤細胞或干擾凋亡抑制基因的功能(如 survinvin基因等)，以誘導腫瘤細胞發生凋亡等［26-27］。

腺病毒的E1A基因是近年來研究較多的與腫瘤凋亡相關的基因。研究發現，E1A基因能夠抑制HER-2基因的轉錄和表達，誘導腫瘤細胞發生凋亡［28］。美國 MD-Anderson腫瘤中心的 Hortobagyi等［29］對E1A基因治療轉移或復發性乳腺癌患者進行了臨床Ⅰ期試驗，實驗人員利用脂質體包裹的E1A基因對6例乳腺癌患者進行每周1次的胸腔或腹腔注射，結果發現治療后腫瘤細胞HER-2表達水平降低，癌細胞的凋亡率增加，而瘤細胞內DNA復制及增殖明顯受到抑制。

8 問題與展望

近年來，生物技術的迅速發展使腫瘤的基因治療不斷取得新的突破，尤其是針對乳腺癌患者的基因治療藥物Herceptin的問世。然而，要使基因治療真正成為乳腺癌綜合治療的一部分，并廣泛用于臨床還有很多問題:①缺乏高效的、特異的導向性載體，因此開發新的、高效的、特異的持續表達靶向載體已成為今后基因治療研究的重要課題。②基因表達的可控性及安全性問題，因而現在的研究趨向于用組織和腫瘤特異性基因啟動子控制靶基因的表達，以此來提高基因治療的效率，減輕其不良反應。③基因治療用于人體時的倫理學問題以及劑量、途徑、安全性等問題也需要全社會的關注和進一步探索、解決。到目前為止，一些乳腺癌致病的關鍵基因或啟動環節尚未最終明確，因而尋找乳腺癌致病的關鍵基因或探討多基因聯合治療的途徑及方法，真正發揮多基因聯合治療的協同作用，并使之應用于臨床是乳腺癌基因治療研究的方向。

［1］van Dillen IJ，Mulder NH，Vaalburg W，et al.Influence of the bystander effect on HSV-tk/GCV gene therapy.A review［J］.Curr Gene Ther，2002，2(3):307-322.

［2］Sacco MG，Mangiarini L，Villa A，et al.Local regression of breast tumors following intramammary ganciclovir administration in double transgenic mice expressing neu oncogene and herpes simplex virus thymidine kinase［J］.Gene Therapy，1995，2(7):493-497.

［3］Shibata MA，Morimoto J，Otsuki Y.Suppression of murine mammary carcinoma growth and metastasis by HSVtk/GCV gene therapy using in vivo electroporation［J］.Cancer Gene Therapy，2002，9(1):16-27.

［4］Albertella MR，Loadman PM，Jones PH，et al.Hypoxia-selective targeting by the bioreductive prodrug AQ4N in patients with solid tumors:results of a phase Ⅰ study［J］.Clin Cancer Res，2008，14(4):1096-1104.

［5］Untch M，Ditsch N，Hermelink K.Immunotherapy:new options in breast cancer treatment［J］.Expert Rev Anticancer Ther，2003，3(3):403-408.

［6］Ligibel JA，Winer EP.Trastuzumab/chemotherapy combinations in metastatic breast cancer［J］.Semin Oncol，2002，29(3 Suppl 11):38-43.

［7］Shen L，Sun X，Fu Z，et al.The fundamental role of the p53 pathway in tumor metabolism and its implication in tumor therapy［J］.Clin Cancer Res，2012，18(6):1561-1567.

［8］Lacroix M，Toillon RA，Leclercq G.p53 and breast cancer，an update［J］.Endocr Relat Cancer，2006，13(2):293-325.

［9］Osborne C，Wilson P，Tripathy D.Oncogenes and tumor suppressor genes in breast cancer:potential diagnostic and therapeutic applications［J］.The Oncologist，2004，9(4):361-377.

［10］Dummer R，Bergh J，Karlsson Y，et al.Biological activity and safety of adenoviral vector-expressed wild-type p53 after intratumoral injection in melanoma and breast cancer patients with p53-overexpressing tumors［J］.Cancer Gene Therapy，2000，7(1):1069-1076.

［11］Cristofanilli M，Khrisnamurthy S，Guerra L，et al.A nonreplicating adenoviral vector that contains the wild-type p53 transgene combined with chemotherapy for primary breast cancer:safety，efficacy，and biologic activity of a novel gene-therapy approach［J］.Cancer，2006，107(5):935-944.

［12］Holstege H，Joosse SA，van Oostrom CT，et al.High incidence of protein-truncating TP53 mutations in BRCA1-related breast cancer［J］.Cancer Res，2009，69(8):3625-3633.

［13］Liu X，Holstege H，van der Gulden H，et al.Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer［J］.PNAS，2007，104(29):12111-12116.

［14］Rebbeck TR，Mitra N，Domchek SM，et al.Modification of brca1-associated breast and ovarian cancer risk by brca1-interacting genes［J］.Cancer Res，2011，71(17):5792-5805.

［15］Goodwin PJ，Phillips KA，West DW，et al.Breast cancer prognosis in BRCA1 and BRCA2 mutation carriers:an International Prospective Breast Cancer Family Registry population-based cohort study［J］.J Clin Oncol，2012，30(1):19-26.

［16］Wilmes LJ，Pallavicini MG，Fleming LM，et al.AG-013736，a novel inhibitor of VEGF receptor tyrosine kinases，inhibits breast cancer growth and decreases vascular permeability as detected by dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging［J］.Magn Reson Imaging，2007，25(3):319-327.

［17］Wedam SB，Low JA，Yang SX，et al.Antiangiogenic and antitumor effects of bevacizumab in patients with inflammatory and locally advanced breast cancer［J］.J Clin Oncol，2006，24(5):769-777.

［18］Wang B，He J，Liu C，et al.An effective cancer vaccine modality:lentiviral modification of dendritic cells expressing multiple cancerspecific antigens［J］.Vaccine，2006，24(17):3477-3489.

［19］Bontkes HJ，Kramer D，Ruizendaal JJ，et al.Tumor associated antigen and interleukin-12 mRNA transfected dendritic cells enhance effector function of natural killer cells and antigen specific T-cells［J］.Clin Immunol，2008，127(3):375-384.

［20］Kenzer MC，Randlev B，Valente N，et al.Intra-tumoral administration of ONYX-015 virus in breast cancer［J］.Proc Am Soc Clin Oncol，2002，21:1903.

［21］Geoerger B，Grill J，Opolon P，et al.Potentiation of radiation thera

py by the oncolytic adenovirus dl1520(ONYX-015)in human ma

lignant glioma xenografts［J］.Br J Cancer，2003，89(3):577-584.

［22］Galanis E，Okuno SH，Nascimento AG，et al.Phase Ⅰ-Ⅱ trial of

ONYX-015 in combination with MAP chemotherapy in patients with advanced sarcomas［J］.Gene Ther，2005，12(5):437-445.

［23］Gomes EM，Rodrigues MS，Phadke AP，et al.Antitumor activity of an oncolytic adenoviral-CD40ligand(CD154)transgene construct in human breast cancer cells［J］.Cancer Res，2009，15(4):1317-1325.

［24］Suzuki T，Anderegg B，Ohkawa T，et al.Adenovirus-mediated ribozyme targeting of HER-2/neu inhibits in vivo growth of breast cancer cells［J］.Gene Therapy，2000，7(3):241-248.

［25］Hu X，Su F，Qin L，et al.Stable RNA interference of ErbB-2 gene synergistic with epirubicin suppresses breast cancer growth in vitro and in vivo［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，346(3):778-785.

［26］Zatelli MC，Luchin A，Tagliati F，et al.Cyclooxygenase-2 inhibitors prevent the development of chemoresistance phenotype in a breast cancer cell line by inhibiting glycoprotein p-170 expression［J］.Endocr Relat Cancer，2007，14(4):1029-1038.

［27］Lafleur EA，Jia SF，Worth LL，et al.Interleukin(IL)-12 and IL-12 gene transfer up-regulate Fas expression in human osteosarcoma and breast cancer cells［J］.Cancer Res，2001，61(10):4066-4071.

［28］Loewenstein PM，Green M.Expression of the Adenovirus Early Gene 1A Transcription-Repression Domain Alone Downregulates HER2 and Results in the Death of Human Breast Cancer Cells Upregulated for the HER2 Proto-Oncogene［J］.Genes Cancer，2011，2(7):737-744.

［29］Hortobagyi GN，Ueno NT，Xia W，et al.Cationic liposome-mediated E1A gene transfer to human breast and ovarian cancer cells and its biologic effects:a phase Ⅰ clinical trial［J］.J Clin Oncol，2001，19(14):3422-3433.