新銀合歡中單寧提取工藝優化研究

李 茂，字學娟,3，周漢林， 劉國道

(1.中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737； 2.中國熱帶農業科學院熱帶草業與畜牧研究所，海南 儋州 571737； 3.海南大學應用科技學院(儋州校區)，海南 儋州 571737)

后生物生產層

新銀合歡中單寧提取工藝優化研究

李 茂1,2，字學娟1,2,3，周漢林1,2， 劉國道1,2

(1.中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737； 2.中國熱帶農業科學院熱帶草業與畜牧研究所，海南 儋州 571737； 3.海南大學應用科技學院(儋州校區)，海南 儋州 571737)

對新銀合歡(Leucaenaleucocephala)中單寧類物質的提取工藝進行優化研究，選擇液料比、提取溫度、提取時間、提取劑體積分數等因素分別進行單因素和正交試驗。結果表明，在液料比40∶1、提取溫度50 ℃、提取時間60 min、丙酮體積分數50%的條件下，單寧提取效果最佳，測得新銀合歡單寧平均含量為2.54%。

新銀合歡；單寧；提取

新銀合歡(Leucaenaleucocephala)為豆科含羞草亞科銀合歡屬多年生灌木或喬木，是我國一種重要的木本豆科飼用植物[1]。新銀合歡葉片干物質中粗蛋白質含量為22%～29%，被聯合國糧農組織的飼料專家譽為干旱地區的“蛋白質倉庫”；且氨基酸、胡蘿卜素、多種維生素和微量元素含量豐富，是聯合國糧農組織向亞太地區推廣的多用途優良樹種之一[1]。1961年8月華南熱帶作物科學研究院(現中國熱帶農業科學院)從中美洲引進少量薩爾瓦多型銀合歡種子，1962年開始試種觀察，繁殖種子[2]。

單寧(Vegetable tannin)是指存在于植物體內的多元酚類物質，并可與蛋白質、生物堿和多糖等化合物發生反應，是一種保護性物質[3-4]。在畜牧業生產中，單寧一般被當作飼料的抗營養因子，特別在熱帶亞熱帶木本飼用植物中含量較高，影響動物的采食和消化。國內許多學者已經從紫花苜蓿(Medicagosativa)、檳榔果(Arecacatechu)、紅豆草(Onobrychisviciaefolia)、山螞蝗屬(Desmodium)、決明(Cassianictitoms)等植物中提取單寧或進行相關研究[5-9]，而新銀合歡的研究主要集中在其栽培技術、營養價值和含羞草素上[10-13]，對其單寧的提取研究較少。本研究建立了新銀合歡中單寧的優化提取工藝，為科學利用新銀合歡資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1植物材料 供試所用新銀合歡(開花期)新鮮嫩莖葉，采集于中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所實驗基地(海南省儋州市)。樣品經殺青后烘干、過80目篩粉碎備用。

1.1.2試劑 單寧酸(C76H52O46)、磷鉬酸、鎢酸鈉、磷酸、無水碳酸鈉、無水乙醇、丙酮、甲醇。

Folin-Denis 顯色劑：10 g磷鉬酸，50 g鎢酸鈉溶于750 mL 蒸餾水中，再加入50 mL 85%的磷酸，煮沸后回流2 h，冷卻定容至 1 000 mL，保存于棕色瓶中。

飽和 Na2CO3溶液：35 g 無水Na2CO3加熱溶解于100 mL水中，冷卻晶體后用快速濾紙過濾，溶液備用。

1.1.3儀器 723PCS可見分光光度計(上海欣茂儀器有限公司)和CHZ-82A 恒溫振蕩器(金壇市富華儀器有限公司)。

1.2方法 標準曲線繪制及單寧提取方法參照字學娟[14]的方法。

1.2.1提取劑的選擇 選用蒸餾水、50%(V/V)丙酮、50%甲醇溶液、50%乙醇溶液，按液料比為50∶1、40 ℃、40 min的條件分別進行提取，測定單寧的含量。

1.2.2單因素試驗 選擇丙酮體積分數、浸提時間、浸提溫度和液料比進行單因素試驗。丙酮體積分數分別設置為20%、30%、40%、50%、60%、70%；浸提時間為20、30、40、50、60和70 min；浸提溫度分別設置為室溫(約20 ℃)、30、40、50、60和70 ℃；液料比分別設置為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1和70∶1。

1.2.3正交試驗 為了驗證各單因素間的相互作用效果,選用對單寧提取影響較大的提取劑體積分數、料液比、提取時間、提取溫度4個因素進行4因素3水平L9(34)正交試驗,確定提取新銀合歡中單寧的最佳工藝參數。

1.2.4回收、重復性試驗 稱取銀合歡20份各1 g，按正交試驗結果中最佳工藝制備浸提液，其中10份樣品浸提液中加入不等量的單寧，對加入單寧的量進行回收試驗。回收率=(加單寧后測得單寧含量-未加單寧測得單寧含量)/加入單寧含量×100%。根據兩種處理試驗結果進行重復性比較。

1.2.5數據處理 采用SAS軟件和Excel軟件進行數據處理和統計分析，方差分析(ANOVA)過程中均值的多重比較采用Duncan法進行。

2 結果與分析

2.1提取條件對單寧提取的影響性

2.1.1提取溶劑對新銀合歡中單寧提取的影響 選用去離子水、50%(V/V)丙酮、50%甲醇溶液、50%乙醇溶液，按液料比為50∶1、40 ℃、40 min的條件進行提取，測定單寧的含量(圖1)。

圖1 不同提取溶劑對新銀合歡中單寧的提取量Fig.1 Effects of extraction solvent on tanninextraction from Leucaena leucocephala

丙酮溶液提取效果最好，甲醇和乙醇提取單寧含量相近，去離子水提取效果最差。甲醇是有毒試劑，使用時易造成安全隱患。在使用乙醇溶液提取的過程中發現，浸提溶液較混濁，過濾十分困難，不利于后續處理。所以選擇對單寧溶解性好、提取率高的丙酮溶液作為提取劑。

2.1.2提取溶劑體積分數對新銀合歡中單寧提取的影響 分別用20%、30%、40%、50%、60%、70%丙酮溶液提取，提取溫度40 ℃，液料比為50∶1，提取40 min，過濾、定容,測定單寧含量(圖2)。

圖2 提取溶劑濃度對新銀合歡中單寧提取的影響Fig.2 Effects of acetone concentration on tannin extraction from Leucaena leucocephala

40%丙酮溶液對單寧的溶解能力最強,丙酮體積分數高于或低于40%時提取率有所下降。這與丙酮的理化性質有關，加入適量的水比純丙酮溶液對單寧的提取量要高，可顯著改善單寧提取效果[15]。

2.1.3提取時間對新銀合歡中單寧提取的影響 提取時間分別為20、30、40、50、60和70 min,用50%丙酮溶液、在溫度40 ℃、液料比為50∶1提取、過濾、定容，測定單寧含量(圖3)。

圖3 提取時間對新銀合歡中單寧提取的影響Fig.3 Effects of extraction time on tannin extraction from Leucaena leucocephala

隨著提取時間的增加，新銀合歡中單寧含量也有所增加，50 min處理單寧含量最高，而后逐漸下降)。說明經過一段時間(約50 min)的提取后樣品與浸提溶液中單寧含量趨于平衡，即已達到浸提最大值。單寧是多酚類物質，丙酮具有一定的氧化性，時間過長可能使單寧部分氧化，導致單寧含量下降。

2.1.4提取溫度對新銀合歡中單寧提取的影響 在相同條件下(50%丙酮、40 min、50∶1液料比)，分別在室溫(約20 ℃)、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃下提取，過濾定容后，測定單寧含量(圖4)。

圖4 提取溫度對新銀合歡中單寧提取的影響Fig.4 Effects of temperature on tannin extraction from Leucaena leucocephala

隨著提取溫度的增加,新銀合歡中單寧含量也有所增加,50 ℃時單寧含量最高，當溫度繼續增高時單寧含量逐漸降低。這是由于溫度較低時，溫度的增高促進單寧在丙酮中的溶解，提取的單寧含量逐漸增加。但是過高溫度單寧易發生降解、縮合、氧化等化學反應，導致提取的單寧含量下降。另外高溫會加快丙酮的揮發，增加了成本。

2.1.5液料比對新銀合歡中單寧提取的影響 在相同條件下(50%丙酮、40 min、40 ℃)，分別在液料比為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1和70∶1下提取，過濾定容后，測定單寧含量，得單寧含量與液料比的關系(圖5)。

圖5 液料比對新銀合歡中單寧提取的影響Fig. 5 Effects of liquid-material ratio on tannin extraction from Leucaena leucocephala

隨著液料比的增加,新銀合歡中單寧含量也有所增加,液料比為50∶1時單寧含量最高(略高于液料比40∶1的單寧含量)，當液料比大于50∶1時，單寧含量逐漸減少。可能是由于液料比過低時樣品與提取液攪拌不均勻，影響了單寧的提取；而液料比過高(即丙酮溶液較多)則增加了單寧的氧化機會，也可能造成提取的單寧含量低。

2.2新銀合歡中單寧提取的正交試驗 通過單因素試驗確定了單寧提取率的主要影響因素為丙酮體積分數、提取時間、提取溫度和液料比，進行正交試驗探討提取的最佳工藝條件，試驗因素和水平見表1。

極差分析可知，4個因素的極差大小為Dgt;Cgt;Bgt;A(表2)，液料比對單寧的提取影響最大，提取時間的影響較小。通過極差分析最優組合為A3B3C2D1，即液料比為40∶1、溫度為50 ℃、提取時間為60 min、丙酮濃度為50%，此時提取的單寧為2.566 1%。

表1 正交試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 單寧回收和重復性測定結果Table 3 Measurement of tannin recycling and reproducibility

2.3新銀合歡中單寧提取最優組合的重復性和回收分析 通過最優組合測得單寧含量平均值為2.54%，標準差為0.03，表明該方法重復性較高；單寧回收率在0.93～1.13，標準差為0.06，回收率較高。

3 討論與結論

單寧類化合物多采用有機溶劑或水提取，但各有優缺點，純有機溶劑提取單寧，可能導致組分不完全[16]；而水的極性較大，溶液雜質多，不利于下一步分離，故一般很少單獨使用有機溶劑或水。前人研究[17]結果表明，單寧在有機溶劑的水溶液中溶解度更大，例如丙酮、乙醇、甲醇等的水溶液。本試驗中使用甲醇、乙醇、丙酮水溶液提取單寧，發現甲醇、乙醇提取單寧的量相當，丙酮水溶液提取單寧含量最高。由于甲醇為有毒試劑，乙醇為易燃易爆化學品，應用前景受限。而丙酮水溶液對單寧的溶解能力很強，能打開單寧―蛋白質的連接鍵，使單寧的提取率提高[18]，綜合各方面因素考慮，最終選用丙酮作為提取劑。

由單因素試驗和正交試驗結果，新銀合歡中單寧的最佳提取條件為液料比40∶1、提取溫度50 ℃、提取時間60 min、丙酮體積分數50%的單寧提取結果最佳，通過重復性和回收試驗，新銀合歡單寧平均含量為2.54%。

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OptimumconditionsonextractionoftanninfromLeucaenaleucocephala

LI Mao1,2, ZI Xue-juan1,2,3, ZHOU Han-lin1,2, LIU Guo-dao1,2

(1.Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou 571737，China; 2.Tropical Grassland and Animal Science Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou 571737, China;3.College of Applied Science and Technology, Hainan University, Danzhou 571737, China)

The optimum conditions, including four main factors: ratio of liquid to material, extraction temperature, extraction time and extractant concentration, for extracting tannins from leaves and stems ofLeucaenaleucocephalawere optimized by using a combined method of single factor analysis and orthogonal experiment design. The results showed that the optimum conditions of each factor in tannin extraction were: ratio of liquid to material 40∶1, extraction temperature 50 ℃, extraction time 40 min and acetone concentration 50%. The extracting rate of the tannin from the leaves and stems ofL.leucocephalawas 2.54%.

Leucaenaleucocephala; tannins; extraction

ZHOU Han-lin E-mail:zhouhanlin8@163.com

Q946

A

1001-0629(2012)02-0301-05

2011-05-03 接受日期：2011-10-10

中央級公益科研院所基本科研業務專項(PZS066)；海南省重點科技項目(090103)；農業科技成果轉化資金項目(2010GB23260578)

李茂(1984-)，男，四川綿陽人，碩士，研究實習員，主要從事熱帶牧草與反芻動物營養研究。

周漢林 E-mail:zhouhanlin8@163.com