牙源性干細胞的研究進展

李 琨，安 瑩 綜述;陳發明，金 巖 審校

(第四軍醫大學口腔醫學院，陜西西安710032)

隨著近代細胞生物學和分子生物學的發展和間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)的發現，為多種組織缺損修復再生治療策略提供了機遇。組織再生依賴于缺損區域細胞、生物材料和信號分子的共同作用，其中足夠的可供新組織形成或再生的干細胞、與缺損組織性能和成分相似的支架材料，以及促進細胞增殖、分化和歸巢的誘導因子等都至關重要［1］。近幾年，醫學領域已經開始探索利用合適的干細胞去實現人體組織和器官的修復和重建，并逐漸聚焦于解決臨床問題［2］。再生醫學已經成為醫學研究的一個重要分支，在將來的臨床治療中必將發揮越來越重要的作用，而干細胞具有自我更新的能力和多向分化的潛能［3］，是再生醫學研究的重點和核心［4］。胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)是多能干細胞，可以分化為多種成體細胞［5］，但因受倫理和法律的限制而在其研究和應用中存在爭議［6］。MSCs是一種多能成體干細胞，最初從人的骨髓中分離得來，隨后又在成人和胎兒的其他組織中發現［7］。成體干細胞(adult stem cells)通常依據其所處部位不同而命名為不同種類的干細胞，例如骨髓干細胞、神經干細胞、牙源性干細胞等。近年來研究表明:來自同一種組織的干細胞也可以產生完全不同的其他組織細胞［3］。成體干細胞與ESCs不同可以用于臨床疾病的治療，如心肌缺血、組織缺損修復、糖尿病和帕金森病等［7］。目前研究表明，在腦、脊髓、外周血、血管、骨骼肌、上皮、視網膜、肝臟、胰腺等3個胚層來源的組織中都發現了成體干細胞，包括牙齒組織。近年來，牙源性干細胞作為組織工程學的候選細胞，越來越引起廣泛的重視和關注［8］，其不僅可用于口腔組織的再生，也適用于非口腔組織如骨和神經等組織的再生［8-9］。本文就常見的牙源性干細胞的研究進展及其在組織工程學中的應用等作一綜述。

目前研究發現在口腔的不同組織中均分離出干細胞［10］。Gronthos等［11］(2000)報道了從人的牙髓組織中分離并培養干細胞的方法，這些干細胞可集落狀生長、體外可誘導分化為成牙本質樣細胞并形成具有牙本質樣結構的組織，從而首次提出了牙髓干細胞(dental pulp stem cells，DPSCs)的概念。隨后，其他組織的牙源性干細胞也陸續被成功分離，包括牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)、乳牙牙髓干細胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED)、根尖乳頭干細胞(stem cells from the apical papilla，SCAP)和牙囊干細胞(dental follicle stem cells，DFSCs)等。目前認為:牙源性干細胞均為存在于口腔組織中的未分化間充質干細胞，具有自我增殖和多向分化的能力，與骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSCs)相比，具有更強的多向分化潛能和更強的誘導成脂、成骨、成神經組織等能力［7］。以下就牙源性干細胞的生物學特性、細胞表型、分化能力、臨床轉化等方面的研究概況進行分述。

1 牙髓干細胞(DPSCs)

Gronthos［10］等(2000)利用酶消化法，將人健康的第三磨牙牙髓制成單細胞懸液進行培養，發現牙髓細胞在體外培養時可自我更新并高度增殖和多向分化;將其移植到免疫缺陷的小鼠體內能產生牙本質-牙髓復合體，而且在一定因素誘導條件下，還能分化為多種細胞，與干細胞的定義相符。于是作者推測，牙髓中可能含有干細胞，并首次提出了牙髓干細胞(DPSCs)的概念［11］。

1.1 DPSCs的來源和細胞表型

Gronthos等［11］(2000)最初推測DPSCs可能來源于血管周圍的微環境;此后shi等［12］(2001)也發現DPSCs表達STRO-1和CD146兩種早期間充質干細胞的表面標志，認為DPSCs與血管組織密切相關。我國學者通過對根髓和冠髓進行比較時發現:DPSCs存在于全部牙髓之中，在根髓中的密度更高［13］。但關于DPSCs的確切來源目前還不甚清楚，因而對其進行確切定位、分離鑒定的研究仍在進行。

關于DPSCs的細胞表型，組織化學染色顯示DPSCs除表達波形絲蛋白、成纖維細胞生長因子等成纖維細胞的標志外，還表達內皮細胞的相關標志如內皮細胞粘附因子VCAM-1、第Ⅷ因子以及平滑肌的標志如平滑肌肌動蛋白和骨標志如Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、骨橋素等;不表達軟骨標志Ⅱ型膠原和上皮細胞的標志EMA［14］。DPSCs細胞表型的多樣性和表達強弱的差異表明:DPSCs克隆株的不均一性，可能是由處于分化和發育不同階段的細胞組成。DPSCs表達平滑肌和內皮細胞的標志，提示其有可能來源于發育的血管［15］。而DPSCs不表達成牙本質細胞特征性蛋白DSP、DMP，則表明DPSCs尚處于未分化狀態［10］。

1.2 DPSCs的生物學特性

1.2.1 DPSCs有高度增殖和自我更新能力

Gronthos等［11］(2000)在體外培養的的第一代DPSCs和BMSSCs中加入Brdu后檢測細胞的增生率發現:DPSCs的增生率高于BMSSCs，DPSCs約有72%陽性細胞，而BMSSCs約有46%陽性細胞;同時還發現DPSCs的克隆形成率為0.22%～0.70%，遠高于BMSSCs的0.024%～0.031%。

1.2.2 DPSCs的多向分化能力

DPSCs具有成體干細胞的可塑性(plasticity)，能夠分化為成骨細胞、脂肪細胞、神經細胞等多種不同細胞［16］。成骨誘導分化實驗顯示:體外礦化誘導DPSCs 40 d后，骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)和骨鈣素(osteocalcin，OCN)免疫熒光染色陽性，可見骨小梁結構;隨后將此骨樣組織回植入免疫缺陷小鼠背部皮下，4周后形成發育良好的板狀骨，表明DPSCs在特定礦化條件下有成骨能力［17］。成脂誘導分化實驗顯示:用含0.5mmol/L異丁基甲基黃嘌呤、0.5(nlU)mmol/L氫化可的松、60(nlU)mmol/L消炎痛的成骨成脂誘導液對DPSCs進行成脂誘導5周后，可見油紅O染色陽性的脂滴;進一步RT-PCR檢測發現，脂肪細胞所具有的兩種特異性轉錄因子表達上調，表明體外培養的DPSCs具有向脂肪細胞分化的潛能［18］。成神經誘導分化實驗顯示:DPSCs在mRNA和蛋白質水平分別表達神經巢蛋白(nestin)和膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acid protein，GFAP)［18］;DPSCs能為多巴胺能的神經元提供營養支持，而且在體外可分化為神經元，表明DPSCs具有向神經細胞分化的潛能［19］。此外，有研究證實:DPSCs經條件培養基的誘導還可分化為肌細胞、軟骨細胞等，進一步豐富了DPSCs可分化的細胞譜系［20］。

生長因子具有促進或抑制細胞分裂增殖、遷移和基因表達的作用。在成年牙髓組織再生、損傷修復過程中，存在于髓周牙本質中的生長因子、特殊的牙髓胞外基質分子以及由修復中的牙髓細胞合成的生長因子和胞外基質分子等細胞因子都對DPSCs的增殖分化起著重要作用，共同形成DPSCs生存、增殖和分化的微環境。如:轉移生長因子家族(TGF-β superfamily)的主要成員TGF-β1可以促進DPSCs堿性磷酸酶的表達，參與修復性牙本質的形成;骨形成蛋白(bonemorphogenetic protein 2，BMP 2)能夠刺激DPSCs分化表達DSPP的成牙本質細胞［21］。牙本質基質蛋白-1(dentin matrixprotein 1，DMP-1)也可促進DPSCs的增殖，對DPSCs堿性磷酸酶活性的促進作用呈濃度依賴性。另有許多研究結果表明:胰島素樣生長因子Ⅰ、腫瘤壞死因子α、表皮生長因子(EGF)等細胞生長因子亦參與DPSCs向成牙本質細胞分化過程的調節［22］。

1.3 DPSCs的應用展望

隨著DPSCs研究的進一步深入和組織工程學的進一步發展，DPSCs為促進牙髓組織再生、牙體修復、自體牙的再造、甚至骨組織的修復重建等開辟廣闊的前景。但牙髓干細胞的研究目前仍面臨很多問題，如DPSCs特異性標志尚不明確，在牙髓組織中的確切定位還不明了，要實現精確的定位分離純化還有一定困難;以及DPSCs數量少、易老化、體外培養擴增難度大、周期長;而且對于干細胞的分裂、分化的具體調節機制尚不清楚，相關的信號分子的作用也還需進一步研究探索等。這些問題均說明:DPSCs還有很大的研究空間，要把DPSCs應用于臨床還需要細胞研究的進一步完善以及組織工程學技術的進一步發展。

2 牙周膜干細胞(PDLSCs)

PDLSCs是近來發現的來源于牙周韌帶組織的成體干細胞。Byoung-Moo等［23］(2004)用酶消化法將健康成年人的牙周膜組織制成單細胞懸液進行體外培養，通過克隆篩選和磁珠分離得到了具有形成細胞克隆能力和高度增殖能力的細胞，從而提出了牙周膜干細胞(PDLSCs)的概念。正常情況下，牙周膜細胞可通過增殖和分化使其本身以及與之相連的牙骨質和牙槽骨處于不斷更新和改建的狀態。而當受到疾病或外界刺激時，則可通過牙周膜中干細胞的不斷增殖和分化使組織再生［24］。

2.1 PDLSCs的來源和細胞表型

研究發現:牙周組織發育完成后存在于牙周膜中的未分化的間充質細胞具有自我更新和多向分化等特點，不少學者認為牙周膜是一個能自我更新的系統，存在原始的能產生不同表型的干細胞或稱為牙周膜前體細胞，這些能導致牙周組織再生的前體細胞主要來源于牙周膜和牙槽骨［25］。

關于PDLSCs的細胞表型，免疫組化結果顯示PDLSC表達間充質干細胞的標志物，而這些標記物是鑒定PDLSC的基礎［26］。包括:間充質干細胞標志物:SRTO-1、CD146/MUC18;腱細胞標志物:堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子(Scleraxis);骨髓間充質干細胞表面標志物:CD90、CD29、CD44、CD166、CD105、CD13等［27］。

2.2 PDLSCs的功能研究

PDLSCs具有成體干細胞的基本特性，即具有自我更新和多向分化的潛能，可產生不同種類的具有特定表型和功能的成熟細胞，以維持牙周膜功能的穩定，發揮生理性細胞更新和修復組織損傷的作用。具有自我更新能力，可以通過分裂維持自身群體的穩定，并能在體外克隆性生長［28］;具有不定向分化潛能，在不同的生長因子微環境條件下，可以誘導向脂肪細胞、成骨細胞、成牙骨質細胞、軟骨細胞和神經元樣細胞分化，還可形成牙骨質、牙周膜和牙槽骨等，是牙周組織再生最直接、最可靠的種子細胞，也是牙周缺損細胞治療和基因治療重要的細胞學基礎［29］。

2.3 PDLSCs的展望

利用干細胞使病變破壞的牙周組織再生已研究多年［30］，PDLSC在體內能使破壞的牙周組織形成新的附著，是牙周組織工程學和牙周組織再生術的重大進步，為以干細胞為基礎的組織工程提供了基礎，在牙周生理功能維持、病理損傷修復中的重要作用和牙周再生方面存在的巨大潛能，必將為口腔基礎和臨床研究打開新的突破口，具有重要的臨床意義和廣闊的應用前景。但因其存在來源有限，培養分離純化擴增過程復雜、周期較長等實際問題，要應用于臨床治療中仍需進一步研究。

3 乳牙牙髓干細胞(SHED)

Miura等［31］(2003)研究發現，正常脫落的乳牙牙髓中的細胞經培養會表現出成纖維細胞樣生長，其增殖率和群體倍增數均比骨髓基質干細胞(BMMSC)、DPSCs高，于是首次提出了SHED的概念。這種細胞在一定的體外誘導條件下具有成骨、成牙本質，以及分化為其他非牙源性間質細胞的能力。

3.1 SHED的來源和細胞表型

對SHED進行表型研究和蛋白組學分析發現，其可表達多種間充質干細胞的特異性分子標志，包括CD73、CD90、CD105、CD146、STRO-1，但是不表達造血干細胞的標志，如CD14、CD34、CD45等，提示SHED很可能來源于間充質［31-32］。Miura等［31］將體外擴增的SHED移植到免疫缺陷小鼠體內，觀察到類牙本質樣結構形成，進一步免疫組化檢測顯示其牙本質特異性蛋白—牙本質涎磷蛋白(DSPP)陽性，表明其可以分化為成牙本質細胞。盡管Miura等證明SHED在體內無法向成骨細胞分化，但Shen YY等［33］(2010)發現SHED在體外培養過程中可以表達成骨細胞的標志，如RUNX-2、OCN、BSP，表明SHED在體外可以分化為成骨細胞;同時Miura等［31］還發現SHED經神經誘導培養后表達多種神經細胞的標志，如巢蛋白、GAD、βⅢ-tubulin、NeuN、GFAP、NFM、CNPase等;經成脂誘導培養，SHED呈現出油紅-O染色陽性的特征，并且半定量RT-PCR檢測顯示過氧化物酶體增殖子活化受體-γ2和脂蛋白脂酶這兩種脂肪細胞特異性的轉錄因子表達上調，提示SHED可以分化為脂肪細胞［33］。

3.2 SHED的功能研究

相關研究表明，SHED具有多向分化功能，Miura等［31］通過將體外擴增的SHED移植到免疫缺陷的動物體內，可觀察到類牙本質樣結構;將SHED接種于支架材料并植入免疫缺陷小鼠皮下，可觀察到牙髓樣結構形成［34］;將SHED與人類牙齒切片復合后，在體外培養或是植入免疫缺陷小鼠皮下，均表達成牙本質細胞分化的標志(DSPP，DMP-1，MEPE)［35］。

有研究發現:SHED移植到裸鼠體內后，雖不能直接分化形成成骨細胞，但可以誘導宿主細胞分化為成骨細胞，提示SHED具有骨誘導功能，而這種功能是DPSCs(甚至其他牙源性干細胞)所不具備的［34］。雖然一系列實驗表明SHED在體內只能誘導宿主細胞分化為成骨細胞［36］，而其自身無法分化為成骨細胞，但在體外培養過程中卻可以分化為成骨細胞，究竟是何種原因導致的這一有趣現象，至今尚未得到解答。此外，在一定的誘導條件下SHED還可以分化為多巴胺能神經元樣細胞;可以向血管內皮細胞分化，同時形成可與宿主脈管系統相吻合的微血管;可以在一定條件下被誘導轉化為人工誘導的多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPS)［7］;SHED可能還具有參與機體的免疫調節等功能［37］。

3.3 SHED展望

SHED自被成功分離以來已被證實具有較強的增殖能力和多向分化的潛能，尤其具有顯著的誘導成骨能力，并且可能參與機體的免疫調節過程，具有廣闊的研究空間。但還有許多具體分子作用機制仍不明確，尚需大量試驗研究去探索。

4 根尖乳頭干細胞(SCAP)

SCAP存在于未完全發育成形的恒牙根尖周組織中，是一種具有高度增生、自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞。Sonoyama等［38］(2006)研究發現:雖然根尖周牙乳頭組織中的血管和細胞成分均較牙髓組織少，但在根髓組織與根尖周牙乳頭組織交界處有一個非常明顯的細胞富集區，而且根尖周乳頭狀組織陽性表達間充質干細胞表面分子STRO-1，從而推測該區域可能存在干細胞或前體細胞。為了證實這種假定的細胞，Abe等［39］(2007)從人年輕第三磨牙根末端分離根尖周牙乳頭，并采用酶消化法從中分離出細胞進行研究，結果發現這種細胞在低密度下培養時，能夠像其他間充質干細胞一樣形成貼壁生長的克隆原細胞聚集，并具有成骨、成牙本質和成脂等多向分化潛能，因而作者將這種細胞命名為SCAP。SCAP是牙根發育時成牙本質細胞的重要來源，在牙根的形成和發育中起著重要的作用，具有強于DPSCs的群體倍增能力以及增殖率、端粒酶活性和細胞遷移率，是一種極具潛力的成體干細胞［40］。SCAP獨特的功能和特點決定了其不僅僅是一種研究牙根發育時成牙本質細胞分化機制的體外細胞，而且是一種很好的牙組織工程種子細胞，可用于牙髓、牙本質的再生和生物學牙根的再生，具有極其良好且廣闊的臨床應用前景。

5 牙囊干細胞(DFPC)

牙囊(dental follicle，DF)是包繞發育牙齒的疏松結締組織［41］，其組織來源于外胚間充質，是牙骨質、牙槽骨和牙周膜的起源組織，含有干細胞和形成牙周組織的前體細胞亞群，在一定誘導條件下進行體外培養時可分化為成骨樣或成牙骨質樣細胞［42］。DFPC可從特定的組織中分離、培養得到，這類干細胞的特點使其在組織工程學研究中具有很大的潛能，可應用于牙周和骨的再生研究。Honda等［41］(2010)從小牛牙根形成階段的恒切牙牙胚中分離出牛DF細胞，進行了一系列試驗，證明DF細胞中含有牙周膜細胞及牙骨質細胞的前體細胞;Luan等［43］(2006)在形態、增殖能力、礦化特征等方面進行了試驗，證實DF前體細胞具有異質性。上述研究結果表明:牙囊中存在具有多向分化潛能的干細胞，在一定誘導條件下可誘導分化為成牙骨質細胞、脂肪細胞和神經元樣細胞。因此，在牙周組織再生的研究中，DF細胞被視為可能的種子細胞，研究前景值得關注。

6 小結

盡管牙源性干細胞的研究和臨床應用雖已取得了許多突破，但其仍處于起步階段，若要成功應用于臨床，實現真正意義上的組織再生，仍有許多理論機制尚待研究，許多技術操作問題尚待克服。然而，因牙源性干細胞本身具備其他組織工程種子細胞所無法比擬的優點，如:自我更新能力強，多向分化潛能大，易于獲得，自體移植免疫排異反應小，不存在倫理上的爭議等，使其在牙齒組織工程學的應用上具有廣闊的前景。有理由相信，隨著牙源性干細胞研究的不斷深入和組織工程技術的不斷發展，將給醫學的理論研究和臨床應用帶來革命性的進展。

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