Lumican蛋白多糖在正常SD大鼠牙胚發育中時間和空間的表達

汪 鳳，黃瑞哲，田劍剛，曹峻嶺

(1.西安交通大學口腔醫院預防科，陜西西安710004; 2.烏魯木齊口腔醫院兒童牙病科，新疆烏魯木齊830000; 3.西安交通大學醫學院地方病研究所、教育部環境與疾病相關基因重點實驗室，陜西西安710061)

Lumican蛋白聚糖是富含亮氨酸的細胞外蛋白多糖中的一種，這類蛋白多糖與胚胎發育，組織修復和腫瘤生長過程中的細胞遷移和增殖有關，并參與組織活動的調節，國內外學者對它的研究多集中在口腔醫學以外的領域［1－2］，在牙齒發育方面未見報道。

Lumican蛋白多糖是一種小的、富含亮氨酸的細胞外基質蛋白多糖，能粘結TGF－β［3］，可以控制細胞的生長、粘附和移行;并能粘附生長因子到細胞外基質，從而調節生長因子的活性［4］。牙胚發育的形態發生和細胞分化是上皮細胞和間充質相互作用的結果，其調控的途徑主要有3條:細胞與細胞的直接接觸;細胞外基質分子及其受體的相互作用;生長因子等可彌散信號分子的相互作用［5］。從分子水平看，這種相互作用包括著多種信號分子、受體、細胞內的轉導途徑以及相關基因的轉錄、表達，形成既相互協同又相互拮抗的網絡調節機制，共同完成牙胚的生長發育［6］。TGF－β作為上皮－間充質細胞的信號調控分子，對牙胚發育有重要作用［7－8］，本研究利用動物實驗和免疫組化手段對Lumican蛋白多糖在牙胚中的分布狀況進行觀察，以期初步揭示Lumican蛋白多糖在牙胚發育過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

80 d齡雌性SD大鼠、90 d齡雄性SD大鼠(西安交通大學醫學院實驗動物中心);兔抗大鼠lumican蛋白多糖一抗(1－C－3)(西安交通大學醫學院地方病研究所曹峻嶺教授惠贈);即用型SABC (過氧化物酶)試劑盒、DAB顯色試劑盒(博士德生物工程有限公司);旋轉式生物組織切片機(YGQ－2，江蘇);光學顯微鏡(OLYMPUS，日本)。

1.2 方法

1.2.1 標本采集和切片

取雌、雄SD大鼠各15只，在發情期間，以雌∶雄=1∶1的比例在晚8∶00時同籠。次日晨6∶00時取走雄鼠，用生理鹽水充分浸濕的棉簽采集各母鼠的陰道內容物并涂于載玻片，用光學顯微鏡在10×15倍下檢查，發現精子者記為陽性(+)，表明已受孕，并以當日中午定為胚胎發育的第0.5 d。然后分別取妊娠17.5 d(E17.5組)、妊娠19.5 d (E19.5組)的孕鼠，處死后取出胎鼠并分離出下頜骨;再取出生后1.5 d(P1.5組)、3.5 d(P3.5組)、5.5 d(P5.5組)的新生鼠并分離出下頜骨。分別從上述所有下頜骨中分離出雙側第一磨牙牙胚，置碘酸鹽－賴氨酸－多聚甲醛固定液中固定后，脫水、石蠟包埋、5 μm切片，多聚賴氨酸包被的玻片撈片，60℃烤片2 h貼片。

1.2.2 HE染色

上述切片常規HE染色，光學顯微鏡觀察，確定SD大鼠牙胚發育時期。

1.2.3 SABC法免疫組化染色

切片脫蠟至水(依次浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min;梯度乙醇 1 000、950、850、750 mL/L各2 min)，蒸餾水洗;用新鮮配置的30 mL/L的過氧化氫液中，室溫30 min以封閉內源性過氧化物酶;蒸餾水洗3次，每次5 min;熱抗原修復，即將切片浸泡于0.01 mol/L的枸櫞酸緩沖液中，電爐上加熱直至沸騰，斷電，靜置10 min，再加熱至沸騰，室溫冷卻，0.02 mol/L的 PBS洗5 min，3次;滴加50 g/L BSA封閉液60 μL封閉，置濕盒內，室溫孵育40 min，甩去多余液體，不洗;滴加1∶100比例稀釋的一抗60 μL，在濕盒內4℃過夜孵育;從4℃冰箱中取出濕盒，在37℃恒溫箱內復溫1 h后取出切片，用0.02 mol/L的PBS洗5 min，3次;滴加生物素化山羊抗兔IgG(二抗)60 μL，濕盒內37℃孵育1 h后，0.02 mol/L的PBS洗5 min，3次;滴加即用型SABC，室溫孵育40 min，0.02 mol/L的PBS洗5 min，4次;去離子蒸餾水1 mL加DAB試劑盒中A、B、C試劑各1滴混勻，每張切片滴加60 μL，顯色3～10 min，顯微鏡下控制反應時間，蒸餾水洗;Harris蘇木素輕度復染胞核;脫水透明中性樹膠封片;鏡下觀察并照相。染色中同時設陰性對照片，滴加PBS代替一抗。

結果判定標準:①陰性表達(－):組織內無淡黃色或棕黃色顆粒，蘇木素復染后呈藍色;②弱陽性表達(±):淡黃色，或陽性著色低于該組織結構的10%;③陽性表達(+):淡黃色或棕黃色顆粒占該組織結構的10%～60%，染色清晰;④強陽性表達(++):淡黃色或棕黃色顆粒占該組織結構的60%以上，染色強。

1.2.4 圖像分析

打開Image－Pro Plus 6.0圖像分析軟件，插入待分析圖片。定義灰度值大的白色為光密度值= 0，灰度值最小的黑色光密度值為無窮大，進行光密度值較正;分別測量累積光密度IOD(Integrated option density)和有效目標分布區域的面積area，以IOD/area計算平均光密度(Mean density)，取同一實驗組切片各照片的平均值。

1.2.5 統計學處理

2 結果

2.1 大鼠牙胚發育過程中Lumican蛋白的時、空表達

2.1.1 E17.5牙胚

第一磨牙牙胚處于帽狀期(增殖期)，分為成釉器、牙乳頭和牙囊3個部分。成釉器分化為3層:外釉上皮層、內釉上皮層和星網狀層，牙板與外釉上皮層相連。此時內釉上皮、牙乳頭、牙囊呈棕黃色，顏色深度與陽性對照相似;外釉上皮、牙板棕黃色略淺，星網狀層染色深度與背景色相似(圖1a)。

2.1.2 E19.5牙胚

第一磨牙牙胚處于鐘狀早期，成釉器由3層分化為4層，出現了中間層細胞，位于內釉上皮層和星網狀層之間，內釉上皮為單層細胞排列，在牙尖部呈高柱狀而在牙頸部頸環處呈矮柱狀。鏡下可見外釉上皮層、內釉上皮、牙囊、牙乳頭黃染，顏色深度與陽性對照類似，頸環處黃染顏色明顯加深，而牙板上皮棕黃色較淺，星網狀層中染色深度與背景色相似(圖1b)。

2.1.3 PN1.5牙胚

第一磨牙牙胚處于鐘狀期(組織分化和形態分化期)，牙胚部位的成釉細胞已開始分泌少量釉基質蛋白。牙乳頭靠近內釉上皮的一層分化出現成牙本質細胞，呈單層排列，并也已開始分泌少量基質。此時成釉細胞黃染，顏色與陽性對照類似;成牙本質細胞黃染略淺;而星網狀層、牙髓細胞中染色深度與背景色相似(圖2a)。

2.1.4 PN5.5牙胚

第一磨牙牙胚處于鐘狀末期，已分泌較多釉基質蛋白。此時成釉細胞、成牙本質細胞黃染程度基本與陽性對照片中的背景色相似，星網狀層、外釉上皮、牙髓細胞中染色深度與背景色相似(圖2b)。

2.1.5 PN9.5牙胚

此時第一磨牙牙胚釉基質蛋白分泌基本結束，但尚未礦化，牙冠基本形成，牙根開始發育。成釉細胞和成牙本質細胞中的染色程度基本與陽性對照片中的背景色相似，牙髓細胞中染色深度與背景色相似(圖2c)。

圖1 胚胎牙胚Lumican蛋白多糖的表達(400×)

圖2 出生后成釉細胞和成牙本質細胞中Lumican蛋白多糖的表達(400×)

根據以上觀察，將各發育時期牙胚中不同細胞的Lumican蛋白多糖表達情況歸納于表1。

表1 各發育時期牙胚中不同細胞Lumican蛋白多糖表達情況

2.2 圖像分析結果

單因素方差分析顯示:總體存在顯著性差異(P＜0.05)，因此可以認為5組Lumican蛋白多糖表達不全相同。進一步組間兩兩比較發現，各組間差異均有統計學意義(P＜0.05)(表2)。

表2 Lumican蛋白多糖在各組中表達的光密度值分析結果

3 討論

牙胚發育過程中，各類細胞的生長、增殖、分化、凋亡均受到細胞外信號分子的誘導和多種基因的調控。目前研究認為:牙胚的發育是上皮－間充質相互誘導、相互作用的結果［9］。轉化生長因子β (transformation growth factors，TGF－β)家族是其中主要的信號分子［10］，研究表明:這種細胞因子與細胞膜受體結合后，在細胞內通過信號轉導分子將信號傳導至核內，調節相應的基因表達，促進細胞的分化和各種功能的正常進行［11］。Lumican蛋白多糖是一種小的、富含亮氨酸的細胞外基質蛋白多糖，Lumican蛋白多糖能粘結TGF－β，并通過控制釋放到細胞外基質中TGF－β的數量來調節TGF－β的活性。Lumican蛋白多糖可以控制細胞生長、粘附和移行，并能粘附生長因子到細胞外基質，從而調節生長因子的活性。

在牙胚發育過程中，內釉上皮產生的信號分子作用于牙乳頭細胞，這些信號分子受上皮－間充質細胞共同調控。TGF－β在上皮－間充質細胞相互作用起信號分子作用，參與調控牙胚發育和細胞分化，而Lumican蛋白多糖可以調節TGF－β的活性，因而推斷Lumican蛋白多糖在發育中呈一定的時空分布可能與調控TGF－β的活性有關，在牙胚正常的發育中起到重要的作用。

在本研究中，E17.5組胎鼠牙胚處于帽狀期，此時成釉器上皮向外胚間充質中生長，體積增大，基底部向內凹陷，成釉器分化為3層，并形成牙囊包繞成釉器與牙乳頭。免疫組化染色結果顯示，此時Lumican蛋白多糖主要分布于牙板、成釉器的外釉上皮、內釉上皮、牙囊、牙乳頭細胞，而星網狀層細胞中則為陰性表達;E19.5組胎鼠牙胚處于鐘狀早期，內釉上皮細胞處于向成釉細胞分化的階段，細胞增殖分化功能活躍，此時外釉上皮層、內釉上皮、牙囊細胞、牙乳頭細胞的Lumican蛋白多糖表達呈陽性，而牙板上皮細胞中的表達減弱;PN1.5組牙胚的成釉細胞開始分泌釉基質蛋白，分泌功能旺盛，此時成釉細胞中的Lumican蛋白多糖表達呈陽性，同時牙乳頭中分化出的成牙本質細胞的胞漿中也有表達。隨著釉基質分泌的結束，成釉細胞分泌功能減退，形態有所變化，開始進入釉基質礦化期，此時可以觀察到PN9.5組中Lumican蛋白多糖在成釉器和牙本質細胞中呈弱陽性表達，上述陽性表達區主要分布在細胞周圍的基質中。

本研究中還觀察到自出生0.5 d起，在牙齒發育的整個過程中，Lumican蛋白多糖在成釉器、牙囊中持續表達，提示Lumican蛋白多糖參與成釉器的分化和成熟。牙齒發育過程中，成牙本質細胞和牙髓細胞都由起源于外胚層間充質的牙乳頭細胞分化而來，二者因為在胚胎發生和功能上相互關系密切，因此又稱為牙本質－牙髓復合體。成牙本質細胞和牙髓細胞都有豐富的合成膠原的能力，而Lumican蛋白多糖在牙乳頭細胞中一直是陽性表達，提示Lumican蛋白多糖也與膠原基質(即前期牙本質)的形成有關。

Lumican蛋白多糖在發育中的必須作用，目前尚不明確，有研究表明:Lumican蛋白多糖可以結合TGF－β，而TGF－β與牙胚發育有關，從而提示Lumican蛋白多糖在大鼠牙胚的發育過程中的作用，可能與介導TGF－β等生長因子有關。Lumican蛋白多糖作為一種重要的細胞外基質蛋白，與機體多種器官的發育密切相關。本研究觀察Lumican蛋白多糖在牙胚的發育過程中的時空表達，表明其在牙胚的發育中主要起著調節和介導作用，而Lumican蛋白多糖在牙胚發育過程中更詳細的機制還有待于進一步實驗證明。

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