脂溶性兒茶素類化合物的制備研究進展

朱晉萱 金青哲 張士康 朱躍進

（1.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122；2.中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州310016）

脂溶性兒茶素類化合物的制備研究進展

朱晉萱1，2金青哲1*張士康2*朱躍進2

（1.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122；2.中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州310016）

兒茶素類化合物是一類具有多種生理活性的多酚類抗氧化劑，本文綜述了國內外利用分子修飾法制備脂溶性兒茶素類化合物的進展。化學法主要利用酰氯在化學催化劑作用下反應制備脂溶性兒茶素，但是酰化反應發生的位點有所不同，總的來說酰基供體碳鏈長度一般大于等于8；酶法主要利用脂肪酶使脂肪酸或脂肪酸酯通過直接酯化或酯交換反應制備脂溶性兒茶素，在兒茶素及其化合物上鍵合烷基，由此提高了兒茶素類化合物在油脂體系中的溶解度，拓展了其應用領域。

脂溶性 兒茶素 茶多酚 分子修飾

兒茶素類化合物是茶多酚的主要成分，包括兒茶素 （C）、表兒茶素 （EC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）[1]。其中又以EGCG的含量最高，也是兒茶素類化合物中抗氧化作用最強的一種成分[1-3]。兒茶素類化合物的結構通式如圖1所示。

兒茶素類化合物是一類具有多種生理活性的多酚類抗氧化劑，其活性部位為分子中的酚羥基，具有抗氧化能力強、安全性高的優點，是一種優良的天然抗氧化劑。但酚羥基的親水性質導致了其易溶于水不易溶于油的溶解特性，這就限制了其在油脂體系中的應用。

圖1 兒茶素類化合物的結構通式Fig.1 The general structure of Catechins Compounds

增強兒茶素類化合物在油脂中溶解度的方法主要有溶劑法、乳化法和分子修飾法等三種[4]，但前兩者并未改變兒茶素化合物的分子結構，僅僅是通過物理溶解或乳化方式使兒茶素化合物分散在體系中，其效果較分子修飾差，形成的抗氧化體系也沒有分子修飾法所形成的體系穩定[5]。這是由于分子修飾法利用生物或化學合成途徑，將某種兒茶素類化合物分子結構的某些部位酰化或酯化，使得新構成的分子由水溶性轉變為脂溶性。研究證實，分子修飾后的脂溶性兒茶素類化合物在油脂體系中的抗氧化效果要優于天然兒茶素類化合物以及BHA[6]和BHT[7]，一定條件下甚至優于TBHQ[8]，其原因是脂溶性兒茶素類化合物在油脂體系中溶解度較改性前增大[9,10]，與油脂中自由基接觸的幾率增加，從而增強了抗氧化效果。

目前所用的分子修飾法主要是化學修飾法和酶修飾法，分別加以介紹。

1 化學修飾法

化學修飾法主要是利用有機試劑作為酰化或酯化的酰基供體和反應催化劑，整個反應過程由有機試劑的種類、濃度和反應溫度控制，所得副產物較多。但是化學修飾法成本較低，容易操作，是目前研究比較多，相對比較成熟的方法。化學修飾法目前主要有氧酰化法 （酰化反應發生在酚羥基上）和碳酰化法（酰化反應發生在芳環上）兩種[11]。

1.1 氧酰化法

兒茶素類化合物分子中的多個酚羥基可與酰氯等酰化試劑在一定的條件下發生O-酰基反應生成酚酯，該酯化反應是一個親核反應。酰化劑羰基上的電子位移使碳上帶有部分正電荷，是一個親電試劑。被酰化物的羥基上具有未共用電子對，因此易于對羰基碳原子發生親核性攻擊，是一個親核試劑。其反應速度和平衡常數與反應物醇（或酚）上的親核性強弱及分子的空間位置有關，親核性越強，空間位阻越小則反應越易進行。而對酰化劑來說，其羰基上陽電荷的大小與脫離基團（在羧酸中為“-OH”，在酰氯中為“-Cl”）的負電性大小有關，即脫離能力越強，碳上的陽電荷增加而使反應活性增加，相反如果脫離基團上的電子易于轉移，脫離能力減弱，則羰基上的陽電荷減少，其酰化能力就減弱。通常采用的酰化劑為酰氯，其反應式可以簡化表示為 R-OH+R’COCl→ ROCO-R’[11,12]。

1.1.1 酰氯氧酰化法

早在20世紀末，沈生榮等[13]已經利用油酸酰氯將水溶性EGCG修飾成油溶性EGCG，修飾后產物的性能較好。近期，許多作者采用長碳鏈的酰氯作為酰基供體與兒茶素類反應，反應溫度一般偏高。為了控制兒茶素類物質的氧化，常用N2對其進行保護[6,12,14,16]。

曠英姿等[12]通過月桂酰氯制備了脂溶性茶多酚，得到制備脂溶性茶多酚的最佳條件是：在氮氣氣氛中，反應溫度控制在75～78℃，用乙酸乙酯作溶劑，將月桂酰氯與茶多酚以物質的量之比為5∶1反應而得到，得到的產品脂溶性較好。張健希等[14]選用3種不同的酰氯 （癸酰氯、月桂酰氯、椰油酰氯）作為原料與茶多酚進行反應，合成脂溶性茶多酚，考察了物料配比、催化劑用量和反應溫度對改性反應的影響，發現茶多酚的脂溶性和抗氧化活性之間存在著一定的關系，得出脂溶性含量在50%～60%的改性產品抗氧化性能最好。通過比較不同酰氯對改性產物活性的影響，得出最佳改性試劑應為碳原子數在12以上的直鏈飽和脂肪酰氯。綜合比較后看出酯化修飾的茶多酚抗氧化性的優勢是最明顯的，它的抗氧化能力優于BHA，與TBHQ持平甚至略好。曾磊等[15]用響應面回歸分析法對茶多酚化學改性的工藝條件優選，確定出水溶性茶多酚與硬脂酰氯改性的最佳工藝條件為：茶多酚、硬脂酰氯、催化劑質量比為 1∶1.21∶0.07， 反應溫度 68.7℃， 反應時間8.5h。在此條件下保護系數為3.25，表現為抗氧化效果最好。在本實驗中確定改性茶多酚的最適添加量為200mg/kg。雖然該實驗中脂溶性茶多酚中仍存在酚羥基，但其數量較茶多酚中的少，而且制得的脂溶性茶多酚的具體結構還有待于進一步的研究。王巧娥等[16]重點研究了反應物配比、催化劑用量、反應溫度和氣氛對反應的影響以及粗產品的純化方法，并初步探討了其抗油脂自動氧化的特性。結果表明，最佳反應條件為：茶多酚、癸酰氯、催化劑質量比為 1∶2.3∶0.05，于氮氣保護、100℃下反應4h后水洗處理。所得產品具有與臺成抗氧化劑BHT相當的抗氧化活性。

1.1.2 脂肪酸氧酰化法

采用普通脂肪酸作為酰化反應的酰基供體，此反應同樣需要適當地控制溫度、催化劑、反應氣氛等因素，使反應在較溫和的條件下進行。此外，反應物的量比也是關鍵因素，它決定著產物的油溶性和抗氧化性。

聶芊等[17,18]采用化學方法制備了豆油脂肪酸茶多酚酯，直接的酰基供體是由豆油脂肪酸制備的豆油脂肪酸酐。通過紅外光譜對產物結構進行了表征，并將豆油脂肪酸茶多酚酯作為油脂的抗氧化劑，添加到大豆油中，考察了其抗氧化性能。結果表明，制備豆油脂肪酸茶多酚酯較佳條件是：茶多酚與豆油脂肪酸的質量比為1∶2.5，在氮氣保護下，溫度80℃，反應時間5h。豆油脂肪酸茶多酚酯具有較好的油溶性，可提高豆油的抗氧化性能，且豆油脂肪酸茶多酚酯的抗氧化活性優于茶多酚和BHT。但是該研究中同樣沒有對產物的詳細結構作分析討論。

1.2 碳酰化法

兒茶素A環的6位和8位具有較高的親核活性，易與酰氯等親電試劑發生親電取代反應，即C-酰基化反應（即Friedel-Crafts酰基化反應）[7,8]。碳酰化法即是在茶多酚的苯環結構上引入酰基，由于酰基的吸電子效應與空間位阻效應，使同一個苯環上難以進行第二次碳酰化，但由于茶多酚分子有多個苯環結構，因此不同的苯環可能分別被酯化，形成多酯衍生物。

盧聰聰[11]首先是改進了常見的氧酰化法，酰基供體采用亞硫酰氯和含有12碳～18碳的脂肪酸反應制備的脂肪酰氯。制備脂溶性茶多酚采用反應溫度為30～45℃，最佳的反應時間8～9h，茶多酚、脂肪酰氯、催化劑摩爾比為 1∶2.0～2.5∶3.5～4.5。以89%～91%乙醇溶液溶解脂溶性茶多酚（LTP）初品，用低極性有機溶劑萃取，濃縮，干燥得到氧酰化法茶多酚。然后考慮到氧酰化反應會減少酚羥基數量，嘗試了在茶多酚的苯環結構中的碳原子上引入酰基，獲得了一種碳酰化反應制備脂溶性茶多酚的方法。使用三氯化鋁為催化劑，硝基苯為反應溶劑，酰基供體仍為亞硫酰氯和含有12碳～18碳的脂肪酸反應制備的脂肪酰氯。兒茶素、催化劑、酰化劑最佳反應物比例為1∶2～3.5∶2～3.5，反應完畢后萃取，分液，濃縮，得到碳酰化脂溶性茶多酚固體。經測定，碳酰化脂溶性茶多酚較氧酰化脂溶性茶多酚具有更強的脂溶性。兩種脂溶性茶多酚都具有良好的抗氧化性能，從抗氧化性和在油脂體系中的穩定性來說都優于除TBHQ外的其他抗氧化劑。

茶多酚的化學法改性工藝已比較成熟，但是化學法本身存在的缺陷也很明顯，一是修飾過程中酚羥基損失較大，導致兒茶素抗氧化活性降低，而且酰化程度越高，它的損失越大。二是長碳鏈的引入對周圍酚羥基產生的屏蔽作用使其參與抗氧化反應的空間位阻增大；同時長碳鏈還會造成聚集，達不到增溶效果。此外化學酰化反應并不是完全定向酰化，其產物是一種含有單酯、雙酯甚至多酯及未反應茶多酚的混合物[19,20]。同時，缺乏專一性的催化條件不利于產物的結構鑒定及其它后續研究。而且化學法中使用的有機反應試劑也限制了改性茶多酚在食品中的應用。所以，近年來，人們越來越多把目光投向了脂肪酶催化修飾法。

2 酶修飾法

Sakai等[21]利用羧酸酯酶進行酯交換制備脂溶性兒茶素。酰基供體為含有1～10個碳原子的烴基。反應體系中，每1mol游離兒茶素通常需要大于1～10mol的酯類化合物。羧酸酯酶的使用量約為每1g游離兒茶素對應10～100000UI，最好是100～5000UI之間。反應的溫度和時間應該保持在20～60℃和1～100h之間，反應的pH應為4～7。為了確定其抗氧化效果，將得到的酰基化兒茶素以0.01～0.1%的重量濃度加入油脂中，得到了安全、有效的抗氧化反應。此抗氧化劑也可與其它常用抗氧化復合使用。

Lambusta等[22,23]由兒茶素或兒茶素五乙酸酯出發，在單一酶假單胞菌脂肪酶的作用下，得到若干兒茶素單乙酸酯或多乙酸酯，提高其疏水性。利用醋酸乙烯酯合成兒茶素乙酯的反應如圖2所示。

圖2 用醋酸乙烯酯酶法合成兒茶素乙酯Fig.2 enzymatic synthesis of acetylcatechins with vinyl acetate

該反應的兒茶素濃度為15.3g/L，非固定化酶濃度為50g/L，酰基供體為醋酸乙酯，最適溶劑為乙腈，在45℃下反應48h，產物為5-O-兒茶素乙酯（得率40%）和7-O-兒茶素乙酯（得率32%）的混合物。利用兒茶素與醋酸乙酯的直接反應得到了很好的衍生物產率。

該酶還可利用兒茶素五乙酸酯，在丁醇/四氫呋喃體系中，通過延長反應時間，分步轉化為兒茶素三乙酯和兒茶素單乙酯，即3-O-乙酰衍生物。在該反應中，C-3位置酯基團的保留是由兒茶素的結構決定的，由此出現了4種不同的3-O-兒茶素乙酰產物，如圖3所示。

圖3 酶法合成兒茶素三乙酯和兒茶素單乙酯Fig.3 enzymatic synthesis of triacetylcatechin and monoacetylcatechin

而Gao等[24]以7-α-D-葡萄糖苷-兒茶素（10～30g/L）為底物，以肉桂酸乙烯酯，咖啡酸乙烯酯，香豆酸乙烯酯為酰基供體，使用Novozym 435脂肪酶（15～44g/L）作催化劑，實驗得最佳溶劑體系為叔丁醇∶吡啶為 9∶1 或者乙腈∶吡啶為 9∶1， 產物為 7-α-D-葡萄糖苷-兒茶素的6〞-O-肉桂酸酯（70%）。

趙峰[25]初步探討了酶法修飾，選用丁醇、叔戊醇為反應介質，分別以丁酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯為酰基供體，確定叔戊醇為實驗反應介質，丁酸乙烯酯為酰基供體。隨后對不同水活度下的反應情況進行研究。研究發現，在叔戊醇體系中，水活度在0.11～0.85之間，Novozym 435脂肪酶可以選擇性催化EGCG與丁酸乙酯的反應。反應后混合液通過LCQDECA液質聯用儀進行了初步鑒定，結果表明EGCG分子上有單一取代的修飾產物，EGCG與酰化反應產物紅外圖譜對比表明，酰化EGCG主體結構與EGCG類似，其分子中引入了四碳鏈的烷基，但是酰化位點并不確定。

對產物的檢測來說，雖然有作者使用了紅外譜圖進行檢測[12]，但是筆者認為一般使用到的更有效的方法是薄層液相色譜（TLC）[25]、高效液相色譜（HPLC）[26,27]以及核磁共振（包括12C譜和1H譜）[28,29]、液質聯用（LC-MS）等手段，也有使用氣質聯用（GC-MS）[11]來進行分析的。通過這些分析檢測方法，在合適的條件下可以得到較為詳細的分子信息[30]。

雖然用酶法可定向進行酰化反應，但反應成本較高，離廣泛推廣應用還有很長一段路要走[31]。

3 結語

脂溶性兒茶素目前主要是采用化學酰化法獲得，當前較多的研究集中在以中長碳鏈脂肪酸酰氯為酰基供體制備脂溶性EGCG以用于油脂的抗氧化，總的來說碳酰化法在保留兒茶素抗氧化活性方面要優于氧酰化法。但脂溶性兒茶素的分子修飾迄今為止還未有十分令人滿意的效果，化學法存在其自身固有的缺陷，如溶劑殘留、反應溫度較高、酰化程度難以控制、產物分析復雜等。故酶法定向酰化反應是制備脂溶性兒茶素最有潛力的方法，它反應條件溫和，副反應產物少，雖然目前已經有一定的探索，但還是以兒茶素乙酰相關研究為主，在長碳鏈酰化以增加脂溶性方面仍需進行深入的研究。例如，催化條件的優化，檢測分析手段的確定等，同時，酶催化脂溶性產物的抗氧化效果、溶解性、穩定性和生物活性等也是將來值得研究的課題和方向。

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Developments in Preparation of Lipid-Soluble Catechins Compounds

ZHU Jin-xuan1,2,JIN Qin-zhe1*,ZHANG Shi-kang2*,ZHU Yue-jin2
(1.School of Food Science and Techology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.Hangzhou Tea Research Institute,CHINA COOP,Hangzhou 310016,China)

Catechin compounds is one kind of polyphenol antioxidant that possess a great physiological activties.In this paper,progress of lipid-soluble catechins’preparation that use molecules modification were reviewed.Chemical method is mainly using carbonyl chlorides and catechin compounds in reaction under the role of chemical catalyst to prepare lipid-soluble catechins.But acylation reaction happened at different locus.The carbon chain length of acyl donors generally is more than 8.Enzymatic modification is mainly using fatty acid or fatty acid ester with catechins under the role of lipase,then direct esterification or ester exchange happened to get lipid-soluble catechins.Alkyl is bonded in catchin compounds,thus solubility in oil system of the catechin compounds is raising,and expand the application fields.

Lipid-soluble,Catechins,Tea polyphenol,Molecular modification

2012-02-09

浙江省茶產業技術創新聯盟項目，脂溶性茶多酚綠色制備及在食品中的應用；院級基金項目，脂溶性茶多酚綠色制備及在食用油中的應用技術研究。

朱晉萱（1987-），女，湖北隨州人，在讀碩士研究生，主要從事脂質深加工與開發工作。

*通訊作者：jqzwuxi@163.com;zsk6510@126.com