茶氨酸復(fù)合劑對酒精性肝損傷大鼠肝臟保護(hù)作用研究

李大偉 張士康* 吳惠嶺朱躍進(jìn) 施海根 宋燕華 張海華

（1.中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016；2.浙江省疾病預(yù)防控制中心，浙江杭州 310051）

茶氨酸復(fù)合劑對酒精性肝損傷大鼠肝臟保護(hù)作用研究

李大偉1張士康1*吳惠嶺2朱躍進(jìn)1施海根1宋燕華2張海華1

（1.中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016；2.浙江省疾病預(yù)防控制中心，浙江杭州 310051）

研究茶氨酸復(fù)合劑對酒精性肝損傷大鼠肝臟的保護(hù)作用。采用小劑量50%乙醇每日1次灌胃1個月建立大鼠慢性酒精肝損傷(AIL)模型；正常大鼠作為空白組；除正常組外，其余各組以等體積50%乙醇每日1次灌胃1個月；對照組以市售海王星辰(HWXC)1.5g/kg，茶氨酸復(fù)合劑低、中、高劑量組分別為0.1、0.2、0.4g/kg的劑量灌胃，1次/d，連續(xù)1個月；以大鼠血液ALT、AST、TG和肝臟病理檢查為主要衡量指標(biāo)，觀察其對肝臟的保護(hù)作用。結(jié)果顯示茶氨酸復(fù)合劑各組與模型組相比大鼠血液ALT、AST、TG含量顯著降低，病理檢查HE染色顯示肝內(nèi)脂變顯著減輕，表明茶氨酸復(fù)合劑對酒精性肝損傷大鼠的肝臟具有保護(hù)作用。

茶氨酸復(fù)合劑 酒精性肝損傷大鼠 保護(hù)作用

肝臟是酒精代謝的主要場所，飲酒后，乙醇在胃及小腸上段吸收入血，約98%乙醇在肝臟內(nèi)代謝，若長期過量飲酒，使乙醇在體內(nèi)不能及時代謝而蓄積，可對肝臟造成不同程度的損傷[1,2]。從組織學(xué)分析，酒對肝器官的損傷可表現(xiàn)為肝臟水腫、肝脂肪化以及不同程度的肝纖維化改變等；從生化指標(biāo)的變化看，可有標(biāo)志肝細(xì)胞線粒體損傷的谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)升高、標(biāo)志肝細(xì)胞膜損傷的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)升高、標(biāo)志肝臟脂肪代謝紊亂的甘油三酯(TG)水平升高等[3]。

茶氨酸復(fù)合劑為中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院研制的以茶氨酸、茶多酚、γ-氨基丁酸、支鏈氨基酸等為主要功效成分配方的復(fù)合氨基酸制劑[4]。前期研究表明[5]，茶氨酸復(fù)合劑可改善肝組織的自由基代謝，減輕肝臟氧化損傷，但對肝功能以及肝組織病理形態(tài)的影響尚未作進(jìn)一步研究。本文的研究，旨在通過觀察茶氨酸復(fù)合劑對酒精性肝損傷大鼠血清 AST、ALT、TG、CHOL、HDL以及肝組織病理形態(tài)的影響，探討茶氨酸復(fù)合劑是否通過降低AST、ALT、TG等指標(biāo)及改善肝組織病理形態(tài)，從而維護(hù)肝功能，以進(jìn)一步闡明茶氨酸復(fù)合劑對酒精性肝損傷大鼠肝臟的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑、儀器

試驗(yàn)動物：健康SD大鼠，清潔級，雄性，體重170～190g，上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2008-0016。動物飼料由浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)GB 14924.1-2001。

茶氨酸復(fù)合劑 (自制，其中L-茶氨酸含量1.5mg/mL)，使用時以30℃蒸餾水溶解；海王金樽片(每片1.0g，深圳海王健康科技發(fā)展有限公司)；無水乙醇(分析純)、多聚甲醛(色譜純)、鹽酸(分析純，杭州華東醫(yī)藥股份有限公司)；ALT試劑盒、AST試劑盒、TG試劑盒、HE染色試劑盒 (南京建成生物工程有限公司)。

3-15K高速冷凍離心機(jī)，Sigma公司；恒溫水浴DK-S26，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電子分析天平，梅特勒-托利多(上海)科技有限公司；UV-2102型紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；TBA-40FR全自動生化分析儀，日本東芝。LEICA-RM2135型切片機(jī)，德國LEICA公司；VANOX AHB-LB型萬能顯微鏡，日本OLYMPUS公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、給藥及取材

清潔級SD大鼠60只，隨機(jī)分成6組，即正常組、模型組、海王金樽組(對照組)、茶氨酸復(fù)合劑低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組大鼠10只，雄性。模型組、海王金樽組、茶氨酸復(fù)合劑低劑量組、中劑量組和高劑量組每頭大鼠分別按7g/kg BW劑量，以50%酒精于每日晨一次灌胃給予；除模型組單純酒精灌胃外，對照組在酒精灌胃同時，每天給予海王金樽片的供試液15mL/kg BW(折合海王牌金樽片的劑量為1.5g/kg BW)。低、中、高劑量組每天分別以0.1、0.2、0.4g/kg BW的劑量灌胃給予茶氨酸復(fù)合劑水溶液；正常組每日僅給予以同樣劑量生理鹽水灌胃一次。動物每3天稱重1次，按體重調(diào)整各給藥組灌胃量，實(shí)驗(yàn)時間為30d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，低、中、高劑量組、模型組及海王金樽組一次灌胃給予50%乙醇14mL/kg BW(折合乙醇的劑量為7g/kg BW)，禁食16h處死大鼠取血，立即3500r/min離心5min，取血清。測定血清ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、AST(天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、TG(甘油三酯)、CHOL(膽固醇)、HDL(高密度脂蛋白)；剝離大鼠肝臟稱重，以10%甲醛固定待檢。

1.2.2 指標(biāo)檢測

a.ALT、AST、TG、CHOL、HDL指標(biāo)檢測參考試劑盒說明書進(jìn)行。

b.肝臟病理組織學(xué)變化、診斷標(biāo)準(zhǔn)和結(jié)果判定：

實(shí)驗(yàn)材料：從肝左葉中部做橫切面取材，固定于10%中性甲醛溶液作常規(guī)石蠟包埋切片(4μm厚)，HE 染色。

鏡檢：從肝臟的一端視野開始記錄細(xì)胞的病理變化，用40倍物鏡連續(xù)觀察整個組織切片。主要觀察脂滴在肝臟的分布、范圍和面積。

c.評分標(biāo)準(zhǔn)[6,7]

表1 肝臟病理評分標(biāo)準(zhǔn)Table1 Liver pathology score

1.2.3 統(tǒng)計方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS15.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，統(tǒng)計方法采用方差分析、秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 對大鼠體重的影響

茶氨酸復(fù)合劑各受試組結(jié)果見表2，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)符合方差齊性要求。實(shí)驗(yàn)各時間點(diǎn)茶氨酸復(fù)合劑各劑量組、對照組(海王金樽)、模型組大鼠體重和空白組比較差異均無顯著性(P＞0.05)。

表2 大鼠體重結(jié)果(n＝10,±S)Table2 Body weight of rats results

表2 大鼠體重結(jié)果(n＝10,±S)Table2 Body weight of rats results

組別Group實(shí)驗(yàn)前體重(g)BW before experiment實(shí)驗(yàn)后體重(g)BW after experiment 1周1st week 2周3周2nd week 3rd week 4周4th week總增重(g)Total weight gain正常組Normal低劑量組Low-dose中劑量組Middle-dose高劑量組High-dose對照組Control模型組Model P 176.5±8.2 174.1±5.0 173.8±6.2 173.6±8.2 173.7±6.9 177.3±7.3 0.749 213.3±7.4 213.5±6.7 203.8±9.5 208.9±11.4 207.4±11.9 210.0±19.7 0.455 265.4±10.0 266.2±14.7 257.5±16.9 265.6±20.1 249.5±19.6 267.7±17.1 0.130 297.6±12.6 299.1±22.9 292.2±21.8 308.0±24.0 285.1±17.1 318.6±22.9 0.065 329.2±14.7 321.4±29.6 321.5±28.5 340.9±30.9 313.5±19.7 343.8±28.7 0.079 152.7±17.3 147.3±30.6 147.6±28.3 167.4±32.0 139.8±19.0 166.5±26.4 0.125

2.2 茶氨酸復(fù)合劑對酒精性肝損傷大鼠血液生化指標(biāo)的影響

由表3可以看出，與模型組比較：高、中劑量組可顯著降低大鼠血清ALT和AST水平 (P＜0.05)；與對照組比較：高、中、低劑量組在降低血清ALT水平方面優(yōu)于對照組，差異顯著 (P＜0.05或P＜0.01)，而高、中劑量組在降低血清AST水平方面優(yōu)于對照組，差異顯著(P＜0.05)。

與模型組、對照組比較：茶氨酸復(fù)合劑高劑量組可顯著降低血清TG水平，具有顯著性差異(P＜0.05)。

茶氨酸復(fù)合劑低、中、高三個劑量組血清HDL及CHOL水平與模型組及對照組比較，無顯著差異(P＞0.05)。

表3 大鼠血液生化指標(biāo)檢測結(jié)果(n＝10,±S)Table3 Test results of blood biochemical parameters in rats

表3 大鼠血液生化指標(biāo)檢測結(jié)果(n＝10,±S)Table3 Test results of blood biochemical parameters in rats

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001

組別Group正常組Normal模型組Model對照組Control高劑量組High-dose中劑量組Middle-dose低劑量組Low-dose ALT(U/L)39.0±8.7***△△△69.0±32.0 80.5±16.8 50.9±9.43*△△53.8±10.2*△△63.3±19.6△AST(U/L)171.8±36.4*△248.2±45.7 264.8±46.9 185.9±33.9*△203.2±34.2*△258.6±42.6 Blood sugal(mmol/L)6.13±0.69 5.71±0.76 5.53±0.64 6.20±0.88 5.43±0.43 5.94±0.69 TG(mmol/L)0.64±0.11*△△1.23±0.39 1.45±0.24 0.86±0.31*△1.36±0.14 1.30±0.67 CHOL(mmol/L)1.05±0.24*△1.30±0.18 1.31±0.37 1.12±0.22 1.16±0.52 1.10±0.58 HDL(mmol/L)1.81±0.10 2.00±0.14 1.76±0.17 1.96±0.15 1.76±0.26 1.84±0.27

2.3 茶氨酸復(fù)合劑對酒精性肝損傷大鼠肝臟病理形態(tài)的影響

2.3.1 肉眼觀察

正常組大鼠肝色鮮紅、邊緣銳利、質(zhì)韌；模型組大鼠肝臟腫大，呈黃褐色，邊緣變鈍，質(zhì)地變軟，切面油膩；治療組大鼠的肝臟腫大程度減輕，色澤較紅。

2.3.2 HE染色病理形態(tài)

茶氨酸復(fù)合劑對酒精性肝損傷大鼠肝臟病理組織形態(tài)影響的觀察結(jié)果和肝臟病理評分見表4，顯微攝影照片見圖1～圖6。

由表4、圖1～圖6分析可知，茶氨酸復(fù)合劑高、中、低各劑量組形態(tài)學(xué)改變與模型、對照組相比均有一定的改善。且高、中劑量組肝臟病理評分較模型組及對照組有顯著性差異 (P＜0.05或P＜0.01)。

表4 大鼠肝臟病理組織形態(tài)評分(n＝10,±S)Table4 Rat liver pathological morphology score

表4 大鼠肝臟病理組織形態(tài)評分(n＝10,±S)Table4 Rat liver pathological morphology score

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

肝臟病理評分Liver pathology score正常組Normal組別Group鼠肝臟病理組織形態(tài)描述Morphological description of the rat liver histopathological肝小葉輪廓清晰，肝索放射狀排列，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，無變性壞死。核居中，肝竇無明顯擴(kuò)張淤血，匯管區(qū)未見炎細(xì)胞浸潤。0.5±0.7**△△模型組Model對照組Control高劑量組High-dose中劑量組Middle-dose中央靜脈周圍肝細(xì)胞索排列紊亂，小葉界限不清，肝細(xì)胞漿中見大小不等較廣泛空泡變性，有程度不等的小葉內(nèi)及門管區(qū)灶性炎性細(xì)胞浸潤，未見纖維間隔形成。 2.0±0.7肝小葉輪廓清晰，肝索放射狀排列，部分肝細(xì)胞呈中度細(xì)胞水腫，部分呈輕度脂肪變性。核居中，部分肝竇表現(xiàn)為擴(kuò)張淤血，肝小葉及匯管區(qū)未見炎細(xì)胞浸潤，部分肝組織見點(diǎn)狀壞死。 1.8±0.5肝小葉輪廓清晰，肝索放射狀排列，部分肝細(xì)胞呈輕度細(xì)胞水腫，核居中，肝竇無明顯擴(kuò)張淤血，肝小葉及匯管區(qū)未見炎細(xì)胞浸潤。形態(tài)學(xué)較接近正常組。 0.9±0.8**△△肝小葉輪廓清晰，肝索放射狀排列，部分肝細(xì)胞呈輕度細(xì)胞水腫，核居中，部分肝竇表現(xiàn)為擴(kuò)張淤血，肝小葉及匯管區(qū)未見炎細(xì)胞浸潤。病變較模型組改善明顯。 1.3±1.0*△低劑量組Low-dose 1.7±0.5肝細(xì)胞索排列稍顯紊亂，部分肝細(xì)胞呈輕度細(xì)胞水腫，核居中，部分肝竇表現(xiàn)為擴(kuò)張淤血，肝小葉及匯管區(qū)未見炎細(xì)胞浸潤。病變較模型組有所減輕。

圖1 正常組（HE，400×）Fig.1 Normal group（HE，400×）

圖2 模型組（HE，400×）Fig.2 Model group（HE，400×）

圖3 對照組（HE，400×）Fig.3 Control group（HE，400×）

圖4 高劑量組（HE，400×）Fig.4 High dose group（HE，400×）

圖5 中劑量組（HE，400×）Fig.5 Middle dose group（HE，400×）

圖6 低劑量組（HE，400×）Fig.6 Low dose group（HE，400×）

3 討論

ALT、AST、TG含量升高是肝損傷的兩個重要指標(biāo)。血清中ALT和AST含量升高的程度也反映了肝細(xì)胞損傷的程度[8]。肝臟組織細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中含有豐富的ALT，而其他組織中含量很少，因此當(dāng)肝臟組織細(xì)胞受到損傷或者壞死時，ALT從肝臟組織細(xì)胞內(nèi)流出釋放入血流，導(dǎo)致了ALT含量的顯著升高[9]。肝臟組織細(xì)胞中80%的AST集中在線粒體，作為細(xì)胞內(nèi)重要的膜性細(xì)胞器，線粒體的膜結(jié)構(gòu)的完善對于細(xì)胞正常行使功能至關(guān)重要[10]。肝臟組織細(xì)胞線粒體膜受損合并細(xì)胞膜受損則將導(dǎo)致線粒體內(nèi)的AST大量釋放到血液當(dāng)中，引起了血清中AST含量的大幅升高。線粒體和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損傷主要和脂質(zhì)過氧化有關(guān)，乙醇進(jìn)入細(xì)胞后，在氧化的過程中，產(chǎn)生大量自由基，當(dāng)自由基的量超出系統(tǒng)的抗氧化清除能力時，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，氧化細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸，最終導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)損傷，致使血清中轉(zhuǎn)氨酶超標(biāo)，因此ALT和AST是肝臟受到損傷的一個綜合指標(biāo)[11]。而血清中TG含量和脂肪代謝有關(guān)，更大程度上反映的是脂質(zhì)過氧化的水平。本研究顯示：酒精性肝損傷模型大鼠的血清ALT、AST活性明顯升高，而茶氨酸復(fù)合劑高、低劑量組可明顯降低血清ALT、AST活性。同時實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，高劑量的茶氨酸復(fù)合劑配方對甘油三酯含量增加較模型組有較明顯的減輕，表明高劑量的茶氨酸復(fù)合劑配方對脂肪代謝影響較大，說明茶氨酸復(fù)合劑可能通過抑制氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)發(fā)揮其保護(hù)肝臟的作用。

此外，茶氨酸復(fù)合劑高、中、低劑量組實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟形態(tài)學(xué)改變與模型、對照組相比均有一定的改善，表明茶氨酸復(fù)合劑在降低及延緩酒精性肝損傷、防止酒精性肝病病情進(jìn)一步惡化方面可能具有較好的作用效果；總體來看，高劑量茶氨酸復(fù)合劑對酒精引起的肝損傷保護(hù)功能顯著。其相關(guān)的藥理和分子機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。

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The Protective Effect of Theanine Complex on the Rat Against Alcoholic Liver Injury

LI Da-wei1,ZHANG Shi-kang1*,WU Hui-ling2,ZHU Yue-jin1,SHI Hai-gen1,SONG Yan-hua2,ZHANG Hai-hua1,
(1.Hang zhou Tea Research Institute,China Coop,Hangzhou 310016,China;2.Zhejiang Provincial Center for Disease Control and Prevention,Hangzhou 310051,China)

The protective effect of theanine complex on rat liver of alcoholic injury was studied by the AIL rat models.The AIL rat models were established by intragastric administration of 50%ethanol per day for a month.60 rats were randomly separated into 6 groups.The administrative doses of theanine complex were 0.1,0.2 or 0.4 g/(kg·d)corresponding to the low,middle and high dose rats model,respectively.The HWXC purchased from local market was selected as control and the administrative dose was 1.5 g/(kg·d).The blank group was oral administration instead with the same dose of water.The evaluation of pathology and biochemical parameters （ALT、AST、TG）was analyzed.The results showed that the contents of ALT,AST and TG decreased significantly in all the doses groups.Pathology demonstrated that theanine complex can protect rat from fatty liver induced by alcohol.In general,the theanine complex has a protective effect on the rat liver with alcoholic injury.

Theanine complex,Alcoholic liver injury in rats,Protective effect

2012-02-09

浙江省茶產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新聯(lián)盟項(xiàng)目；茶資源高效利用與跨界產(chǎn)品開發(fā)新技術(shù)集成研究示范

李大偉（1983-），男，吉林長春人，助理研究員，從事天然產(chǎn)物化學(xué)與生物學(xué)研究。

*通訊作者：zsk6510@126.com