干細(xì)胞因子SOX2調(diào)控Wnt／β－Catenin信號通路在腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)生中的機(jī)制研究

吳偉，李鵬，薛平

（1.成都市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科，四川 成都 610016；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，四川 成都 610041）

腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）是成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)腫瘤，由于該病具有很強(qiáng)的侵襲能力，生長迅速，患者死亡率及復(fù)發(fā)率較高，預(yù)后差。隨著腫瘤干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)與深入研究，腫瘤干細(xì)胞理論隨之產(chǎn)生［1］，GBM的治療得到了有效改善。研究表明，經(jīng)典Wnt信號通路參與胚胎發(fā)育的各個(gè)階段，它的異常激活可導(dǎo)致腫瘤的形成。Wnt信號通路能夠使β－catenin蛋白激活特定的靶基因，因此β－catenin是該傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)中心［2］。GBM是與Wnt信號系統(tǒng)激活密切相關(guān)的腫瘤，不同級別GBM大都伴有 Wnt信號激活［3］。SOX2作為全能型或多能性干細(xì)胞標(biāo)記物，是維持干細(xì)胞未分化狀態(tài)、增殖等方面的關(guān)鍵因子之一，在人類許多腫瘤中SOX基因均呈異常表達(dá)。本研究通過檢測腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）組織中干細(xì)胞因子SOX2及β－Catenin蛋白的表達(dá)，探討 SOX2及 Wnt／β－Catenin信號通路在GBM中的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量（200～250）g，由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2 主要試劑及儀器

大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6購自上海豐翔生物公司；小鼠抗人SOX2多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)公司；β－catenin抗體購自上海萬安生物技術(shù)有限公司；小鼠超敏二步法免疫組化試劑盒（PV－9005）購自北京欣興唐生物科技有限公司；新生小牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、D－Hanks＇液、B27添加劑、重組人表皮生長因子（EGF）、重組人堿性成纖維生長因子（FGF）、Fc段封閉抗體均購自武漢子心生物科技有限公司。桌面型數(shù)字腦立體定位儀68025購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。Gyroscan T5－NT 0.5T磁共振機(jī)由Philips醫(yī)療器械公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將C6細(xì)胞置入含10%新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)基、5%CO2，37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 動(dòng)物造模

取70只SD大鼠固定于立體定向儀上，2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，切開頭皮，暴露顱骨標(biāo)志，在矢狀縫右旁開3mm，前后囪中點(diǎn)前1mm處用牙鉆鉆一骨孔。靜脈注射套管針抽取50μl C6細(xì)胞懸液，經(jīng)骨孔垂直于顱骨外板向腦尾狀核注射，最后縫合頭皮，同時(shí)肌注青霉素1萬U。術(shù)后3周對大鼠行磁共振掃描，篩選成瘤細(xì)胞大鼠65只。

1.2.3 GBM干細(xì)胞的分化、鑒定及原代培養(yǎng)

模型大鼠處死取腦部腫瘤組織，PBS反復(fù)沖洗，去除壞死組織。將腫瘤組織剪切為0.5mm組織塊，制成單細(xì)胞懸液，篩網(wǎng)過濾，PBS沖洗離心，DMEM＋F12培養(yǎng)液（按1：50添加B27；EGF及FGF的終濃度為20ng／ml）重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)／ml后，置于培養(yǎng)瓶內(nèi)傳代培養(yǎng)。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組

將剩余20只正常大鼠處死，取其腦組織按上述方法培養(yǎng)作為對照組，原代培養(yǎng)的GBM干細(xì)胞重懸于100μl培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組。

1.2.5 免疫組化法檢測SOX2及β－catenin的表達(dá)

分別取上述單細(xì)胞懸液涂片，100%冷丙酮4℃固定5min，依次加入SOX2一抗（稀釋度為1：100）及β－catenin一抗（稀釋度為1：1600），采用免疫組織化學(xué)SP法檢測，步驟按試劑盒說明書操作。用已知的陽性切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為空白對照，正常腦組織作為陰性對照。

1.2.6 結(jié)果判定

以細(xì)胞膜或／和胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒即定為陽性，無棕黃色顆粒為陰性。隨機(jī)選擇5個(gè)以上高倍視野（×400），每張切片選取具有代表性的腫瘤區(qū)域在鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，測定陽性細(xì)胞百分率，排除壞死區(qū)和血管內(nèi)皮細(xì)胞。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以SPSS 13.0軟件包分析數(shù)據(jù)，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Spearman相關(guān)分析分析目標(biāo)蛋白的相關(guān)關(guān)系，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SOX2、β－catenin蛋白在 GBM 干細(xì)胞及正常腦組織中的免疫組化染色

SOX2蛋白在GBM干細(xì)胞中呈陽性表達(dá)，主要表達(dá)于細(xì)胞核，正常腦組織中未見陽性表達(dá)。βcatenin蛋白在GBM干細(xì)胞細(xì)胞核也可見大量陽性染色細(xì)胞，正常腦組織陽性染色細(xì)胞少見，見圖1。

2.2 SOX2及β－catenin蛋白在GBM干細(xì)胞及正常腦組織中的表達(dá)

SOX2及β－catenin蛋白在GBM干細(xì)胞組織中的陽性表達(dá)強(qiáng)度分別為56.92%和43.08%，明顯高于正常腦組織的0和15.0%，見表1。

表1 SOX2及β－catenin在GBM干細(xì)胞及正常腦組織中的表達(dá)

2.3 SOX2及β－catenin蛋白在肺癌干細(xì)胞表達(dá)的相關(guān)性

SOX2及β－catenin蛋白在肺癌干細(xì)胞表達(dá)的呈正相關(guān)，r＝0.372，P＜0.05。

3 討論

隨著干細(xì)胞研究的深入，多種腫瘤組織如腦膠質(zhì)瘤、卵巢癌、胃癌等中的腫瘤干細(xì)胞已被成功分離鑒定，這些干細(xì)胞是腦膠質(zhì)瘤的“種子”細(xì)胞，具有自我更新、增殖和多向分化潛能等干細(xì)胞屬性［4］。

表2 SOX2與β－catenin蛋白表達(dá)的相關(guān)性

隨著分子生物學(xué)在腫瘤發(fā)展中的應(yīng)用，越來越多的基因和信號通路被證明與膠質(zhì)瘤的形成有關(guān)。Wnt／β－Catenin通路是腫瘤生成過程中重要的通路之一，且與多個(gè)通路聯(lián)系密切，β－Catenin是該通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤的生物學(xué)行為調(diào)控中起重要作用。Wnt／β－Catenin通路在各種腫瘤中呈現(xiàn)異常激活狀態(tài)，有文獻(xiàn)報(bào)道，惡性膠質(zhì)瘤中β－Catenin的高表達(dá)影響著包括細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡等各種惡性表型在內(nèi)的生物學(xué)行為［5］。Porath等［6］通過基因芯片方法發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞樣基因的高表達(dá)是低分化腫瘤的分子機(jī)制。SOX2是Wnt信號通路的調(diào)控因子，作為干細(xì)胞基因，能夠通過與其靶基因結(jié)合的方式調(diào)控胚胎及組織的發(fā)育，在乳腺癌、胰腺癌、肺癌等多種腫瘤組織中均有表達(dá)。

通過圖1～2我們發(fā)現(xiàn)，SOX2及β－Catenin蛋白在GBM干細(xì)胞中均有大量陽性染色細(xì)胞，而正常腦細(xì)胞中無SOX2陽性染色細(xì)胞，也僅有少量β－Catenin陽性表達(dá)細(xì)胞。另外，表1顯示，GBM干細(xì)胞中SOX2蛋白陽性表達(dá)率為56.92%，正常腦組織中未見SOX2表達(dá)，二者之間有顯著差異性（χ2＝3.836，P＜0.05），提示干細(xì)胞基因SOX2在 GBM的發(fā)生過程中可能發(fā)揮了重要作用。同時(shí)，β－Catenin在GBM干細(xì)胞中陽性表達(dá)率為43.08%，顯著高于正常腦組織的陽性表達(dá)率（15.0%），組間比較差異顯著（χ2＝3.652，P＜0.05），提示 β－Catenin在GBM干細(xì)胞中呈高表達(dá)，也證實(shí)了當(dāng)發(fā)生GBM時(shí)，Wnt／β－Catenin信號通路處于異常激活狀態(tài)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。從表2中我們看出，在GBM干細(xì)胞中，SOX2與β－Catenin均呈高表達(dá)，二者的表達(dá)呈正相關(guān)（χ2＝0.372，P＜0.05），由此我們推測，在肺癌GBM干細(xì)胞中，高表達(dá)的SOX2基因，通過調(diào)控 Wnt／β－Catenin信號通路使其異常激活，共同參與了GBM的發(fā)生。

綜上所述，干細(xì)胞因子SOX2可能通過調(diào)控Wnt／β－Catenin信號通路，在GBM的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，為針對GBM干細(xì)胞治療該病提供了新靶點(diǎn)。

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