厄貝沙坦片的人體生物等效性研究

程春燕，李 珍＊，張逸凡，李松華

（1.第二軍醫大學長海醫院藥學部，上海200433；2.中國科學院上海生命科學院藥物研究所藥物代謝研究中心，上海201203；3.第二軍醫大學長海醫院心血管內科，上海200433）

［本文編輯］陽凌燕

厄貝沙坦（irbesartan）是一種口服血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，在高血壓、充血性心力衰竭等的治療中發揮著重要作用，有降壓作用顯著、藥物不良反應小，口服吸收良好等優點［1，2］。本研究采用 LC－MS／MS法［3］測定24例健康受試者口服厄貝沙坦片（受試制劑）和原研廠生產的厄貝沙坦片（參比制劑）的血藥濃度，求算藥動學參數和相對生物利用度，并進行生物等效性評價，為臨床合理用藥提供依據。

1 受試對象和試藥

1.1 受試對象 24例男性健康受試者，年齡（20.6±1.0）歲，體 重（66.42±5.59）kg，身 高（172.79±4.88）cm，體重指數（22.22±1.18）kg／m2，試驗前體格檢查和實驗室檢查均未見異常，無藥物與食物過敏史，無煙、酒嗜好及濫用毒品史，篩選前2周內未服用過可能影響本研究結果的藥物，入選前3個月內未參加過其他藥物臨床試驗且無獻血史。試驗方案經第二軍醫大學長海醫院倫理委員會批準后實施。所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 藥品和試劑 受試制劑：厄貝沙坦片（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，0.15g／片，批號080306518）；參比制劑：厄貝沙坦片（商品名 安博維，杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司，0.15g／片，批號1805）。厄貝沙坦對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號100607－200301，純度99.9%）；氯沙坦鉀對照品（深圳倍素特公司，批號1370462，純度99.9%）；甲醇和乙腈為色譜純（美國Sigma公司）；醋酸銨和甲酸為色譜純（美國Tedia公司）；水由法國Millipore公司純水機制備。

2 方法和結果

2.1 試驗設計和血樣采集 24例男性健康受試者隨機分成2組，每組12人。受試者禁食至少10h，次日晨空腹用200ml溫開水送服0.15g片劑，一組服用受試制劑，另一組服用參比制劑。受試者服藥后2h內禁水，4h后給予統一標準餐。7d的清洗期后，兩組受試者交叉服用藥物，于服藥前和服藥后0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、16、24、36h 于肘靜脈采血2ml，肝素抗凝，9×102×g離心10min，分取血漿于－20℃冰箱保存。

2.2 血藥濃度測定方法

2.2.1 儀器 Agilent 1100液相色譜系統（包括G1311A型四元輸液泵、G1367A型自動進樣器、G1316A型柱溫箱和G1322A型脫氣機，美國Agilent公司）；TSQ Quantum Ultra型三重四極桿串聯質譜儀，配備電噴霧電離源（ESI源），數據采集使用Xcalibur 2.0.7軟件（美國 Thermo Finnigan公司）。

2.2.2 色譜條件和質譜條件 色譜柱為Zorbax SB C18柱（150mm×4.6mm，5μm，美國 Agilent公司）；C18保護柱（3.0mm×4.0mm，5μm，美國Phenomenex公司）；流動相為乙腈－水－甲酸（90∶10∶0.25）；流速為0.5ml／min，柱溫為20℃。離子源為電噴霧電離源，源噴射電壓4.0kV，加熱毛細管溫度為320℃，鞘氣（N2）壓力為0.6MPa，輔助氣（N2）流 量 4.8L／min，碰撞氣（Ar）壓 力0.16Pa。厄貝沙坦和內標氯沙坦鉀的碰撞誘導解離（CID）電壓分別為20和45eV，正離子方式檢測，掃描方式為選擇反應監測（SMR）。用于定量分析的離子反應分別為厄貝沙坦m／z429→207和氯沙坦m／z423→207，掃描時間為0.3s。

2.2.3 標準溶液配制 精密稱取厄貝沙坦對照品適量，用甲醇溶解并配成濃度為1.00mg／ml的厄貝沙坦儲備液Ⅰ。取200μl儲備液Ⅰ，用甲醇∶水（50∶50）稀釋至 1.00ml，得厄貝沙坦濃度為200μg／ml的儲備液Ⅱ，再以甲醇∶水（50∶50）稀釋得 濃 度 依 次 為 8、4、1.6、0.4、0.16、0.04、0.012μg／ml的厄貝沙坦系列標準溶液。同法制備濃度為6.4、0.4、0.03μg／ml的質控樣品。以甲醇溶解并稀釋，制得濃度為1μg／ml的氯沙坦鉀內標溶液。各儲備液、系列標準溶液、質控溶液及內標溶液均以相應體積，經校正的移液器和容量瓶配制，并在4℃冰箱內保存備用。

2.2.4 血漿樣品的預處理 向100μl血漿中分別加入50%甲醇溶液50.0μl，內標溶液25.0μl（1μg／ml氯沙坦溶液）和200μl乙腈，渦旋混勻，8.6×103×g離心5min。取100μl上清液于40℃空氣流下吹干。殘留物溶于200μl流動相中，取10 μl進行LC－MS／MS分析。

2.2.5 標準曲線及最低定量濃度的確定 取空白血漿100μl，配制成相當于厄貝沙坦血漿濃度為0.006、0.02、0.08、0.2、0.8、2.0和4.0μg／ml的樣品，按2.2.4項下操作，每一濃度進行雙樣本分析，進樣10μl，記錄色譜圖。以待測物濃度為橫坐標（X），待測物與內標物的峰面積比值為縱坐標（Y），用加權最小二乘法進行回歸運算，加權系數W＝1／x2?；貧w方程為Y＝1.72×10－2X＋4.37×10－3，r＝0.999 6，厄貝沙坦的線性范圍為 0.006～4.0μg／ml，最低定量濃度為0.006μg／ml。

2.2.6 回收率和精密度實驗 取空白血漿100μl，按2.2.3項下方法制備低、中、高3個濃度（厄貝沙坦片血漿濃度分別為0.015、0.2和3.2μg／ml）的質控樣品，每一濃度進行6樣本分析，連續測定3d，根據當日的標準曲線，計算質控樣品的測得濃度。同時另取空白血漿100μl，除不加系列標準溶液和內標溶液外，向上清液中分別加入低、中、高3個濃度的質控溶液50μl和內標溶液25μl，渦旋混合，按2.2.4項下操作，取10μl進行LC－MS／MS分析，得相應峰面積。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計算方法回收率，分別為（92.2±3.5）%、（98.6±4.1）%和（93.8±4.9）%；根據質控樣品結果計算得厄貝沙坦每一濃度水平的質控樣品日內RSD均＜4.5%，日間RSD均＜11.0%。

2.2.7 穩定性實驗 血漿樣品室溫放置2h后，經沉淀蛋白質處理后在室溫放置24h、經歷3次冷凍－解凍循環、－20℃放置30d后穩定，厄貝沙坦儲備液于4℃放置30d后穩定。

2.2.8 基質效應 厄貝沙坦低、高濃度基質效應分別為106%和110%，且RSD均＜3.1%；內標基質效應為109%，RSD為5.2%。結果表明，在本研究選擇的色譜和質譜條件下，可忽略基質效應的影響。

2.3 藥動學參數和相對生物利用度 本研究所測得的血藥濃度數據用非房室模型進行計算，cmax和tmax用實測值表示，AUC0～t用梯形法計算，AUC0～∞＝AUC0～t＋ctn／λz，tn是最后一次可實測濃度的取樣時間；ctn是末次可測定樣本藥物濃度；λz是對數血藥濃度－時間曲線末端直線部分求得的末端消除速率常數，可用對數血藥濃度－時間曲線末端直線部分的斜率求得；t1／2用公式t1／2＝0.693／λz計算。根據公式F＝AUCT／AUCR×100%計算受試制劑的相對生物利用度，結果見表1。受試制劑和參比制劑的平均血藥濃度－時間曲線見圖1。

表1 健康受試者單劑量口服0.15g厄貝沙坦后的主要藥動學參數Table 1 Main pharmacokinetic parameters after a single oral dose of 0.15g test and reference irbesartan tablets in healthy volunteers（n＝24，）

表1 健康受試者單劑量口服0.15g厄貝沙坦后的主要藥動學參數Table 1 Main pharmacokinetic parameters after a single oral dose of 0.15g test and reference irbesartan tablets in healthy volunteers（n＝24，）

組別 cmax（ρB／μg·ml－1） tmax（t／h） t1／2（t／h） AUC0～t（A／μg·h·ml－1）AUC0～∞（A／μg·h·ml－1） F（%）受試制劑 1.89±0.54 1.63±0.92 10.9±6.1 9.58±2.56 10.23±2.98 110.5±21.6參比制劑 1.99±0.46 1.52±0.83 11.4±7.7 8.90±2.87 9.56±2.93 100

圖1 健康受試者單劑量口服0.15g厄貝沙坦片后厄貝沙坦的平均血藥濃度－時間曲線Figure 1 Mean plasma concentration－time curves of irbesartan after a single oral dose of 0.15g irbesartan tablet in healthy volunteers

2.4 生物等效性評價 將受試制劑與參比制劑的AUC0～t和cmax經對數轉換后用方差分析、雙單側t檢驗和90%置信區間法判斷。結果AUC0～t和cmax均拒絕生物不等效假設，受試制劑AUC0～t的90%置信區間為參比制劑相應參數的102.4%～115.0%，cmax的90%置信區間為參比制劑相應參數的86.3%～103.2%，tmax無顯著性差異（P＞0.05）。2.5 臨床觀察 單次口服0.15g受試制劑和參比制劑后，24例受試者均順利完成兩周期試驗。3例因血壓下降引起短時間的頭暈、頭痛，1例咳嗽，程度均為輕度，經研究者判定與試驗藥物可能相關，未經處置，均自行恢復，無嚴重不良事件發生。

3 討 論

本研究采用LC－MS／MS法測定健康人血漿中的厄貝沙坦濃度［3］，因乙腈質譜響應高于甲醇，故選擇乙腈為流動相，同時加入少量甲酸（乙腈∶水∶甲酸為90∶10∶0.25）來提高待測物的離子化效率，避免了由于沉淀蛋白質帶來的離子抑制。本方法具有準確、選擇性強、靈敏度高的特點，適合于厄貝沙坦片的人體藥動學和生物等效性研究。

所有受試者在給藥前后進行的各項檢查數據均正?；虍惓o臨床意義，說明單次給予試驗藥物厄貝沙坦片安全性和耐受性良好。本研究所得厄貝沙坦的藥動學參數與文獻報道［4，5］基本一致。方差分析、雙單側t檢驗和90%置信區間分析結果表明，厄貝沙坦片受試制劑與參比制劑具有生物等效性。

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