熱療增強長春瑞濱對人肺癌PLA - 801D細胞株毒性的實驗研究

孫勝杰，吳志勇，焦順昌（解放軍總醫院腫瘤內科，北京 100853）

肺癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，發病率日漸升高。在我國，肺癌占常見惡性腫瘤的首位，死亡率名列城市腫瘤死亡率的首位［1］。針對肺癌的化療在臨床上占有重要的地位，但其遠期療效較差。近年來，熱療作為一種新的治癌方法正引起醫學界的重視，尤其是熱療與化療聯合應用，可以提高某些化療藥物的敏感性[2-6]。本研究旨在探討溫熱對長春瑞濱增敏的規律及機制，為臨床治療提供實驗參考。

1 材料和方法

1.1 藥品和試劑

RPMI/1640培養液（GIBCO公司），胎牛血清（北京元亨圣馬生物技術研究所），MTT（AMRESCO公司）；二甲基亞砜（DMSO，天津市科密歐化學試劑開發中心），碘化丙啶（PI，Sigma公司）和RNA酶（Sigma公司）；長春瑞濱（NVB，法國Pierre Farmos）。

1.2 主要儀器

WJ-301TVBA二氧化碳孵箱（美國Baxter），96孔板（美國COSTOR-3599），Multiskan MK3 353酶標儀（上海雷勃分析儀器有限公司），YKH-Ⅱ型液體快速混合器（江西醫療器械廠），XPTH-42電熱恒溫循環水槽（北京煤炭利用研究所，溫度波動在±0.1 ℃）。

1.3 細胞培養與計數

人肺巨細胞癌細胞株（PLA - 801D）由解放軍總醫院病理科提供，細胞用RPMI/1640培養液(含10%胎牛血清，100 u·mL-1青霉素，100 u·mL-1鏈霉素)，置于37 ℃，5%CO2培養箱中常規傳代培養。細胞制成懸液，加20 g·L-1臺盼藍染液混勻，細胞計數板計數活細胞數。全部實驗用細胞均處于對數生長期。

1.4 MTT法測定肺癌細胞生長抑制率達30%時的NVB濃度（IC30）

取對數生長期的人肺巨細胞癌細胞按0.6×106· mL-1的密度接種于96孔板（200 μL/孔）, 培養24 h使其完全附壁后，加入以1.5倍倍比稀釋的18個不同濃度的NVB溶液（初始濃度5 mg · mL-1），縱向順序重復3孔。在37 ℃、5%CO2及飽和濕度的條件下培養1 h將藥液快速吸出并加入新鮮培養液200 μL，培養24 h后加入濃度為2.5 g·L-1的MTT試劑20 μL，4 h后快速翻板倒出含有MTT的培養液，每孔加入150 μL的DMSO，振蕩5 min后酶標儀（測定波長492 nm）測定每孔OD值。按下列公式計算各濃度的抑制率：抑制率（%） = 1 – （實驗組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。以抑制率為縱坐標，藥物對數濃度為橫坐標軸繪制該細胞株的藥物劑量-效應曲線圖，同時計算出抑制率達30%時的NVB濃度（IC30）。

1.5 MTT法測定NVB與溫熱以不同時序性聯合對肺癌細胞的抑制率

取38、39、40、41、42、43 ℃6個熱療溫度，每個溫度下分別設立熱療前24 h化療組、熱療前18 h化療組、熱療前12 h化療組、熱療前6 h化療組、熱化療同時作用組、熱療后6 h化療組、熱療后12 h化療組、熱療后18 h化療組、熱療后24 h化療組9種不同時序性的熱化療結合方式。具體步驟為：1）取同一培養瓶的PLA-801D細胞以同樣的條件接種于兩板96孔培養板（濃度0.6×105·mL-1，200 μL/孔)，其中一板為對照板（包括單純細胞對照和不同時間點的單純化療對照），另一板為實驗板（包括單純熱療組和以不同時序性結合的熱化療聯合組）；2）兩板細胞培養24 h待其完全附壁后，于第0、6、12、18、24、30、36、42、48 h分別在兩板細胞的3、4、5、6、7、8、9、10、11列加入抑制率為30%的NVB溶液（每列縱向重復5孔），每次作用1 h后吸凈上清液，加入新鮮培養液200 μL。其中，第24小時加藥后立即將實驗板放入設定溫度的電熱恒溫循環水槽中加熱，溫熱與藥物同時作用1 h后棄上清液；3）待吸凈第48小時的上清液（即第11列）后將細胞培養12 h，加入MTT，4 h后酶標儀（測定波長492 nm）測定每孔OD值；按下面公式計算各個溫度下熱療與NVB以不同時序性結合對肺癌細胞的抑制率：抑制率（%）=1 – （實驗組平均OD值/細胞對照組平均OD值）×100%。

1.6 流式細胞儀分析

取42 ℃溫熱條件下的細胞對照組、單純熱療組、單純化療組、先化后熱組（熱療前1.5 h化療）、熱化同時組（熱療與藥物同時作用1 h）、先熱后化組（熱療后1.5 h化療），將各組按實驗步驟處理后，收集細胞，70%乙醇于–20 ℃固定過夜，洗滌后RNA酶作用30 min，加入碘化丙啶（PI）50 μg·mL-1，4 ℃下避光染色，30 min后流式細胞儀檢測,分析各組細胞周期分布。

1.7 統計學分析

采用SPSS11.0統計軟件處理數據。以t檢驗、單因素方差分析比較兩組和多組間的（±s）；線性相關與直線回歸分析兩個變量之間的相互關系；P ＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT法測定肺癌細胞生長抑制率達30%時的NVB濃度（IC30）

不同濃度的NVB對PLA-801D細胞作用1 h后,抑制率與藥物濃度呈正相關，通過直線回歸分析求出NVB濃度（x）與抑制率（y）的回歸方程：y＝0.019 55＋0.004 07x，計算NVB的IC30約為68.91 μg·mL-1。

2.2 MTT法測定NVB與各個溫度下的熱療以不同時序性聯合對肺癌細胞的抑制率

42 ～ 43 ℃的單純熱療可直接殺傷肺癌細胞，38 ～ 41 ℃的單純熱療（抑制率為負值）促進了肺癌細胞的增長（與細胞對照組相比，P值均 ＜ 0.001）；不同溫度下的熱療與NVB聯合應用時，熱化同時作用組對肺癌細胞的抑制率最高，既高于單純熱療組和單純化療各組，也高于先化后熱各組和先熱后化各組（P值均 ＜ 0.01），而且隨著溫度的升高，熱化同時作用組的抑制率也升高，即溫度與抑制率呈正相關（r＝0.921 7，P ＜ 0.01）；42 ～ 43 ℃的熱療與NVB聯合應用時，各組的抑制率均高于相對應時間點的單純化療組（P值均 ＜ 0.05），而38 ～ 41 ℃的熱療與NVB聯合應用時，除熱化同時作用組（P值均 ＜ 0.001）外，其余各組（P值均 ＜ 0.05）的抑制率均低于相對應時間點的單純化療組（見圖1）。

在38 ～ 43 ℃溫熱條件下，熱療前6 h化療組和熱療后6 h化療組之間的抑制率有較大幅度的變化，為了進一步研究此段時間內曲線的變化趨勢，我們又將此12 h細分為熱療前4.5 h化療組、熱療前3 h化療組、熱療前1.5 h化療組、熱化療同時作用組、熱療后1.5 h化療組、熱療后3 h化療組、熱療后4.5 h化療組等結合方式，熱療、化療每次均為1 h，熱療溫度取42 ℃，結果見圖2。

圖1 38 ～ 43 ℃溫熱與NVB以不同時序性聯合對肺癌細胞生長的抑制率曲線（48 h內）A - 熱療前24 h；B - 熱療前18 h；C - 熱療前12 h；D - 熱療前6 h；E - 熱療時間；F - 熱療后6 h；G - 熱療后12 h；H - 熱療后18 h；I - 熱療后24 h；與熱化療聯合時間對應的單純化療對照組；不同序貫方式結合的熱化療聯合組；單純熱療組Fig 1 The curves of inhibited rates to PLA - 801D of the groups of combined treatment of 38 - 43 ℃ hyperthermia and NVB in different sequences(within 48 h)A - 24 hours before hyperthermia; B - 18 hours before hyperthermia; C - 12 hours before hyperthermia; D - 6 hours before hyperthermia;E-hyperthermia time; F-6 hours after hyperthermia; G-12 hours after hyperthermia; H-18 hours after hyperthermia; I-24 hours after hyperthermia)single chemotherapy group;hyperthermia-chemical combination treatment group;single thermotherapy group

圖2 結果顯示：熱化同時組對肺癌細胞的抑制率仍然最高，而且熱療后3 h內進行化療對肺癌細胞的抑制率也較高（與其余各組相比，P 值均 ＜ 0.05）。

2.3 NVB與42 ℃溫熱以不同的時序性聯合對細胞周期的影響

NVB屬細胞周期特異性藥物，它主要使細胞周期阻滯于M期，故單純化療時，處于G2/M期的細胞增多；S期細胞對高熱最敏感，故單純42 ℃熱療主要作用于S期，使S期細胞減少；與單純化療組相比，熱化同時組、先熱后化組（熱療后1.5 h化療）和先化后熱組（熱療前1.5 h化療）的G0/G1、S期細胞所占比例增加，G2/M期細胞減少，其中以抑制率最高的熱化同時組變化最大，抑制率較高的先熱后化組次之，抑制率較低的先化后熱組最小，即各組抑制率與細胞周期的影響程度有關。具體見表1及圖3。注：與對照組相比，P＜0.05

圖2 42 ℃溫熱與NVB以不同時序性聯合對肺癌細胞生長的抑制率曲線（12 h內）A - 熱療前6 h；B - 熱療前4.5 h；C - 熱療前3 h；D - 熱療前1.5 h；E - 熱療時間；F - 熱療后1.5 h；G - 熱療后3 h；H - 熱療后4.5 h；I - 熱療后6 hFig 2 The curves of inhibited rates to PLA-801D of the groups of combined treatment of 42 ℃ hyperthermia and NVB in different sequences (within 12 h)A - 6 hours before hyperthermia; B - 4.5 hours before hyperthermia;C - 3 hours before hyperthermia; D - 1.5 hours before hyperthermia;E - hyperthermia time; F - 1.5 hours after hyperthermia; G - 3 hours after hyperthermia; H - 4.5 hours after hyperthermia;i- 6 hours after hyperthermia

表1 肺癌細胞經42 ℃溫熱與NVB處理后各細胞周期的變化.%，n = 6， ±sTab 1 The changes in cell cycle of lung carcinoma cells treated with 42 ℃ hyperthermia and vinorelbine. %, n = 6, ±s

表1 肺癌細胞經42 ℃溫熱與NVB處理后各細胞周期的變化.%，n = 6， ±sTab 1 The changes in cell cycle of lung carcinoma cells treated with 42 ℃ hyperthermia and vinorelbine. %, n = 6, ±s

注：與對照組相比，P ＜ 0.05Note：compared with control group, P＜0.05

組別 G0/G1期 G2/M期 S期細胞對照組 41.63±1.40 16.31±0.56 42.06±0.89單純化療組 5.35±1.13 76.24±2.26 18.41±1.55單純熱療組 46.36±3.89 22.78±3.84 30.86±0.05先化后熱組 7.26±0.72 66.37±3.43 26.37±2.73熱化同時組 14.70±1.61 34.66±5.89 50.64±4.28先熱后化組 7.61±2.49 58.92±5.54 33.47±3.32

3 討論

近幾年關于熱療對化療增敏作用機理的研究[7-8]認為：1)熱療提高了瘤細胞膜的通透性，有利于化療藥物的滲透和吸收，從而保持細胞內較高的藥物濃度。細胞內藥物濃度的大小，直接關系到治療效果，而細胞通常可以通過藥泵將藥物泵出細胞外，導致發生耐藥。高溫可以使細胞膜的生物完整性受到破壞，通透性升高，促進藥物通過細胞膜進入細胞。2）高溫改變藥物在體內的代謝，增加細胞內藥物的堆積，增強靶結構的敏感性，提高藥物對細胞的殺傷力，抑制抗癌藥引起的癌細胞損傷修復，防止和減輕耐藥性的發生。3）熱療可以促進化療藥物誘發的細胞凋亡。

圖3 42 ℃溫熱與NVB以不同時序性聯合對細胞周期的影響a – 細胞對照組；b – 單純化療組；c – 單純熱療組；d – 先化后熱組；e – 熱化同時組；f – 先熱后化組Fig 3 Effect of 42 ℃ hyperthermia combination with NVB in different sequences on cell cyclea – cell control; b – simple chemotherapy; c – simple hyperthermia;d – hyperthermia after chemotherapy; e – hyperthermia and chemotherapy；f – chemotherapy after hyperthermia

本研究顯示，42 ～ 43 ℃的高溫對肺癌細胞有殺傷作用，這可能由于癌細胞加熱至42 ℃左右時呼吸受抑制，而癌細胞內外因糖的分解造成乳糖蓄積，pH值下降，細胞內溶菌酶活性加強，從而殺滅癌細胞。另外，S期細胞對高熱最敏感，處于S期的細胞受熱后膜的損傷嚴重，可出現染色體畸變，形成多核細胞，分裂后死亡，導致S期細胞所占比例減少[9-10]。38 ～ 41 ℃的單純熱療促進了肺癌細胞的生長，可能與細胞生長周期同步化有關，因為較低的溫度時細胞損傷較輕，導致細胞分裂遲滯，細胞生長周期趨向于同步化，造成細胞增生，提示對于腫瘤患者，單純的亞高溫熱療（38 ～ 41℃）是不可取的[11-12]。而在臨床熱療中，給患者升高溫度需要一個過程，這不可避免會使患者處于一段較長的低熱（38 ～ 41 ℃）期，并且腫瘤組織各部分的受熱也不均勻，高溫時僅一部分（中心部位）處于42 ～ 43 ℃，其余大部分腫瘤的溫度處于39 ～ 42 ℃[13]。

本實驗結果表明：亞高溫或高溫熱療與化療同時作用以及熱療后3 h內進行化療的結合方式均能夠提高長春瑞濱的細胞毒作用，其中尤以熱化療同時進行效果最佳。分析原因可能是由于熱療使細胞膜的生物完整性受到破壞，通透性升高，致使化療藥進入細胞內的量增多，增強了細胞毒作用[14]。但隨著熱療后進行化療間隔時間的逐漸延長，因高熱受損的細胞膜逐步得到修復，致使進入細胞內的長春瑞濱的量逐漸減少，間隔時間超過3 h后，細胞膜完全得到修復，溫熱的增敏作用也就停止了。細胞周期分析進一步發現，與單純化療相比，熱化同時組處于G2/M期的細胞所占比例顯著減少，可能是熱化同時組主要使阻滯于G2/M期細胞的死亡率（和或凋亡率）增加所致，有些學者認為熱化療聯合能夠在基因水平和蛋白水平顯著下調 CyclinD1和PCNA 的表達，推測由于細胞周期相關蛋白的改變進而引起細胞周期阻滯可能是熱化療抑制細胞增殖的機制之一[15-17]。另一方面，S期細胞對高熱最敏感，而長春瑞濱主要作用于癌細胞的M期，這提示高熱與長春瑞濱并用時，對肺癌細胞各期均有協同殺傷作用。

總之，本研究從細胞水平初步探討了溫熱對化療藥長春瑞濱增敏的規律，所選用細胞株的增殖特點與一般肺癌細胞株相似，另外，該細胞株具有倍增時間短、分裂指數高、增殖倍數大等特點，但要進一步應用于臨床實踐, 還有待于從動物實驗水平上進行驗證。