熒光定量PCR分析兒童EB病毒感染與異型淋巴細胞相關(guān)性

周建峰 夏獻顆 陳 平

湖南省湘潭縣人民醫(yī)院，湖南湘潭 411200

熒光定量PCR分析兒童EB病毒感染與異型淋巴細胞相關(guān)性

周建峰 夏獻顆 陳 平

湖南省湘潭縣人民醫(yī)院，湖南湘潭 411200

目的 了解兒童感染EB病毒（EBV）后外周血中異型淋巴細胞（異淋）的比值。 方法 熒光定量PCR測定外周靜脈血的EBV拷貝數(shù)；確定EBV感染后，分3組：EBV感染組、住院對照組、健康對照組，各100例，取外周血涂片染色，進行白細胞分類計數(shù)，統(tǒng)計異淋比值。 結(jié)果 EBV感染組異淋為（5.7±3.3）%，與住院對照組[（2.1±1.2）%]比較， 差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與健康對照組[（1.0±0.9）%]比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）；住院對照組與健康對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。100例EBV感染組中有20例異淋高于10.0%，100例住院對照組中，有3例異淋高于10.0%，100例健康對照組無一例異淋高于10.0%，3組比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在EBV感染組，有15.0%（15/100）異淋≤2.0%。結(jié)論EB病毒在體內(nèi)復(fù)制水平與異性淋巴細胞的比值成高度正相關(guān)，其中也存在個體差異。熒光定量PCR檢測EB病毒具有特異性強、靈敏性和準確性高的優(yōu)點。

EB病毒；兒童；異型淋巴細胞；熒光定量PCR

EB病毒是皰疹病毒科r亞科中唯一能引起人類感染的淋巴濾泡病毒，受EB病毒感染后，部分患兒因病情得不到控制，感染經(jīng)久不愈，甚至繼發(fā)其他惡性疾病，早期診斷并及早治療至關(guān)重要。熒光定量PCR技術(shù)是近年來各醫(yī)院確診各種病毒感染的一種技術(shù)，直接從分子水平反應(yīng)病毒在體內(nèi)的復(fù)制水平，本文筆者采用熒光定量PCR分析兒童EB病毒感染與異型淋巴細胞相關(guān)性，報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

采集本院兒內(nèi)科2011年4月～2012年3月的住院兒童患者EBV感染組和住院對照組各100例；另選100例本院兒保科健康體檢兒童為健康對照組。患者中有發(fā)熱、上呼吸道感染、淋巴結(jié)腫大、皮膚出血點、肝脾腫大、嘔吐腹瀉等各種臨床表現(xiàn)。其中，男184例，女116例，這些患者年齡最大6歲，最小3個月。

1.2 儀器與試劑

儀器：達安公司生產(chǎn)的lightcycler熒光定量PCR儀；試劑：EB病毒核酸擴增熒光定量檢測試劑盒購于中山大學(xué)達安基因股份有限公司，瑞氏染液由東耀生物科技郵箱公司（臺灣）提供。

1.3 方法

所有研究對象均于入院時抽取2 mL外周靜脈血EDTA抗凝，封閉送檢。用實時熒光定量PCR法檢測住院兒童患者血樣中EB病毒 DNA，EB病毒DNA陽性患者作為EB病毒感染組，EB病毒DNA陰性患者作為住院對照組，經(jīng)體檢確定健康的兒童作為健康對照組。取各兒童手指末梢血1滴做血涂片，經(jīng)瑞氏染色液染色后，在顯微鏡下進行鏡檢，分類計數(shù)白細胞，統(tǒng)計異淋比值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 平均異淋比值的比較

3組年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。EBV感染組異淋比值為（5.7±3.3）%，與住院對照組[（2.1±1.2）%]比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義 （P<0.001）；與健康對照組 [（1.0±0.9）%]比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）；住院對照組與健康對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.2 異淋比>10.0%的比較

100例EBV感染組中有28例異淋比例高于10.0%，100例住院對照組中有3例異淋比例高于10%，100例健康對照組無一例異淋高于10%，3組比較差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表 1。

表1 平均異淋比值及異淋比 >10.0%的比較（n）

2.3 異型淋巴細胞比例和EB病毒copy數(shù)的比較

在EB病毒感染組，有15.0%（15/100）異淋≤2.0%，異淋>6.0%的共69例。而在住院對照組僅有14例異淋>6.0%，見表1。通過EB病毒感染組內(nèi)比較，隨著EB病毒的拷貝數(shù)的增加，異型淋巴細胞比例也顯著上升。見表2。

表2 異型淋巴細胞比例和EB病毒copy數(shù)的比較（±s）

表2 異型淋巴細胞比例和EB病毒copy數(shù)的比較（±s）

異淋比 例數(shù)（n） Log EB病毒濃度（copy/mL）異淋≤2%2%＜異淋≤6%6%＜異淋≤10%異淋＞10%15 16 41 28 3.4±1.2 3.8±1.3 4.4±1.2 6.3±2.1

3 討論

EB病毒是皰疹病毒科r亞科中唯一能引起人類感染的淋巴濾泡病毒，廣泛存在于自然界，人類普遍易感[1]。人群中病毒感染以兒童期感染最多，因此是兒科中常見的一種病毒性傳染病，全身多個系統(tǒng)包括肝、脾、淋巴結(jié)、腎、心臟、肺、骨髓、腦等均可被感染，但以網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)病變?yōu)橹鳌２《靖腥竞蟀Y狀不定，病情有輕有重，可以出現(xiàn)典型的傳染性單核細胞增多癥，還可出現(xiàn)其它復(fù)雜的臨床表現(xiàn)，包括病毒潛伏[2]。受EB病毒感染后，部分患兒因病情得不到控制，感染經(jīng)久不愈甚至繼發(fā)其他惡性疾病[3]。因此，早期診斷并及早治療至關(guān)重要。

隨著研究的不斷深入，目前發(fā)現(xiàn)小兒外周血異型淋巴細胞升高在其他病毒感染的疾病中也會出現(xiàn)[4]，如在水痘－帶狀皰疹病毒（varicellazoster virus）、肝炎病毒（HBV）、巨細胞病毒 （cytomegalovirus）， 漢 坦 病 毒 屬 （hanta virus）、 登 革 病 毒（dengue virus）等感染的患者血涂片中均發(fā)現(xiàn)了異型淋巴細胞[5]，說明異型淋巴細胞數(shù)量的升高對診斷EB病毒感染還缺乏特異性。長期以來，臨床診斷EB病毒感染的傳統(tǒng)方法一直由血清法占據(jù)主導(dǎo)地位，其檢測對象是人體對病毒的免疫應(yīng)答。但是兒童免疫功能尚未成熟，所以測定的抗EBV抗體很容易導(dǎo)致漏診[6]。EB病毒表面抗原IgM（EB-VCA-IgM）度過窗口期1～2周后，引起人的免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗體，持續(xù)約1～3個月，在疾病早期檢測時，陽性率較低，且此抗體在被EB病毒再次感染或免疫抑制的患者中通常不表現(xiàn)升高，易導(dǎo)致假陰性結(jié)果[7]。因此，即使用血清法檢測EB病毒表面抗原IgM為陰性，也不能排除EBV感染。熒光定量PCR技術(shù)是近年來各醫(yī)院確診各種病毒感染的一種技術(shù)，直接從分子水平反應(yīng)病毒在體內(nèi)的復(fù)制水平。其操作方法簡單，檢測速率快，可批量進行臨床標(biāo)本檢測。由于EBV在感染人體后首先在咽部上皮細胞復(fù)制，因此，用Real time-PCR法檢測患者咽拭中EB病毒DNA，可以早于用血清法檢測抗EB病毒抗體[8]。

綜上所述，通過熒光定量PCR的檢測，發(fā)現(xiàn)EB病毒在體內(nèi)復(fù)制水平與異型淋巴細胞的比值成高度正相關(guān)，具有診斷意義，但其中也存在著個體差異。熒光定量PCR法檢測EB病毒為臨床診斷提供真實可靠的依據(jù)，是值得推廣的一種技術(shù)手段。

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Fluorescence quantitative PCR analysis of correlation between EB virus infection and abnormal lymphocyte in children

ZHOU Jianfeng XIA Xianke CHEN Ping
The People's Hospital of Xiangtan County in Hu'nan Province,Xiangtan 411200,China

Objective To understand the ratio of abnormal lymphocyte in Peripheral blood after Epstein-Barr virus(EBV)infection in children.Methods The copies of EBV in perifheral blood were determined by Fluorescence quantitative,and were divided into three groups after the infection of PCR,including EBV-infected group,hospitalized control group and health control group,and there were 100 cases in every group.Peripheral blood was taken to smear dyeing,white blood cells classification was counted,and the ratio of abnormal lymphocyte was stated.Results The proportion of atypical lymphocytes in EBV-infected group was(5.7±3.3)%,there was significant difference between EBV-infected group and hospitalized control group of(2.1±1.2)%,and health control group(1.0±0.9)%(P<0.01)respectively.There was no significant difference between hospitalized control group and health control group(P>0.05).There were 20 cases with proportion of atypical lymphocytes above 10.0%in EBV-infected group,3 case in hospitalized control group,and no case in health control group,respectively.There was significant difference between three groups(P<0.01).And there were 15.0%(15/100)of abnormal lymphocyte which was less than or equal to EBV-infected group 2.0%.Conclusion Epstein-Barr virus replication levels in vivo have highly positive correlation with the ratio of atypical lymphocytes,in which there are individual differences.Detection of Epstein-Barr virus by fluorescence quantitative PCR has the advantages of high specificity,high sensitivity and high accuracy.

Epstein-Barr virus;Child;Atypical lymphocytes;Fluorescence quantitative PCR

R446

A

1674-4721（2012）11（a）-0097-02

2012-05-09 本文編輯：魏玉坡）