植物凝集素親和色譜層析法分離缺糖基轉(zhuǎn)鐵蛋白診斷酒精性肝病的臨床研究*

陳 欣 陸 偉 張俊富

天津市第一醫(yī)院肝病研究所 (天津，300232)

慢性酒精中毒可改變轉(zhuǎn)鐵蛋白糖基化，常引起轉(zhuǎn)鐵蛋白丟失某些糖基末端鏈，如唾液酸、半乳糖和N-乙酰氨基葡萄糖，因此將這種異常轉(zhuǎn)鐵蛋白命名為缺糖基轉(zhuǎn)鐵蛋白 (carbohydrate deficient transferrin，CDT)。CDT與Tf在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別在其糖鏈上。正常Tf具有兩個雙天線糖鏈，共4條支鏈。每條支鏈均含有 siaα26Galβ14GlcNAc殘基 (即 tetrasialo-transferrin，四唾液酸轉(zhuǎn)鐵蛋白)，CDT則缺失支鏈末端的唾液酸殘基 (SA)。

已經(jīng)證明每天飲酒60克以上的人81%轉(zhuǎn)鐵蛋白可出現(xiàn)這種微異質(zhì)性變化，重度飲酒至少一周才出現(xiàn)CDT升高，戒酒后CDT恢復(fù)正常，其半衰期約15天。CDT作為酗酒標志的臨床研究首先由Stilber等［1］于1991年進行了綜合報道。

目前，酒精性肝病 (ALD)的診斷缺乏特異性生化指標，臨床上多根據(jù)病史、臨床表現(xiàn)及門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (AST)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶 (GGT)、紅細胞平均體積 (MCV)等指標綜合分析做出診斷，其敏感性和特異性均較低，國外學(xué)者對CDT進行了廣泛研究，取得了許多進展，多數(shù)學(xué)者認為CDT是至今唯一較為特異性的診斷酒精性肝病的實驗室指標，在ALD患者血清中，CDT/Tf比值升高。

本研究應(yīng)用植物凝集素親和色譜層析法分離CDT和Tf，再應(yīng)用ELISA方法測定CDT和Tf，并與正常人血清中這兩項值比較，觀察酒精性肝病患者血清缺糖基轉(zhuǎn)鐵蛋白 (CDT)水平變化并探討其診斷ALD的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 ALD組30例，為我所2006年4月-2007年4月住院及門診患者，診斷符合中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組 (2006年2月修訂)有關(guān)ALD的診斷標準［2］。近兩周尚未戒酒。全部為男性，年齡40～65歲，平均 (48.5±5.8)歲。對照組20例為正常體檢人員，男14例，女6例，年齡37～60歲，平均 (45.7±4.7)歲。兩組人員在性別、年齡、病情、病程方面比較，差異無顯著性意義 (P＞0.05)，具有可比性。

1.2 方法與試劑儀器 兩組人員均于清晨空腹抽取靜脈血5ml，并分離血清保存于-80°C超低溫冰箱備用。采用植物凝集素親和色譜層析法分離CDT和Tf，ELISA方法測定CDT和Tf，計算CDT/Tf的比值。其中Allo-A凝集素為日本神戶大學(xué)生物化學(xué)系饋贈，CNBr-activateSepharose4B為美國 Pharmacia出品，Tf ELISA試劑盒為美國TPI公司原裝進口，實驗器材包括蛋白層析儀 (美國)、紫外分光光度儀 (日本島津)、酶標儀 (Biored-550)(美國)等。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 組間資料比較采用方差分析、t檢驗，數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標準差表示。

2 結(jié)果

2.1 兩組人員CDT、TF及COT/TF檢測值 見表1。

2.2 兩組人員血清植物凝集素親和層析洗脫圖譜見圖1，2。兩圖均顯示兩個洗脫峰，CDT存在于第一洗脫峰，Tf存在于第二洗脫峰。

表1 兩組人員CDT、TF及CDT/Tf比較 ()

表1 兩組人員CDT、TF及CDT/Tf比較 ()

與對照組比較，△P＜0.05

圖1 植物凝集素親和層析洗脫圖譜(ALD患者血清)

圖2 植物凝集素親和層析洗脫圖譜 (正常人員血清)

3 討論

酒精誘導(dǎo)CDT升高的機制目前尚未完全清楚，很可能是乙醇和/或其代謝產(chǎn)物乙醛影響了高爾基器中N-糖鏈的合成。一項試驗的結(jié)果發(fā)現(xiàn):酒精飼喂的鼠肝質(zhì)膜中唾液酸酶活力升高而高爾基體勻漿中唾液酰基轉(zhuǎn)移酶、半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶活力下降，在人類也得到類似結(jié)果。而在正常飼喂的對照鼠高爾基體勻漿中，加入乙醛后也能觀察到這種轉(zhuǎn)移酶活力的丟失。他們的結(jié)論是由乙醇(或其代謝產(chǎn)物乙醛)介導(dǎo)的肝唾液酸酶活力的升高和高爾基組分中的糖蛋白糖基轉(zhuǎn)移酶 (唾液酰基轉(zhuǎn)移酶、半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶)活力的降低很可能是酒精導(dǎo)致鼠和人血清中CDT升高的原因［3］。酗酒者半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和N-乙酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶活性降低，乙醛可使該酶活性進一步降低。戒酒硫可阻斷乙醛脫氫酶，使乙醛在體內(nèi)積聚，但不影響血清CDT水平。用3H標記亮氨酸和N-乙酰-D-甘露糖胺，發(fā)現(xiàn)乙醇灌注鼠Tf合成降低，α2，6-SA轉(zhuǎn)移酶mRNA減少，從而α2，6-SA轉(zhuǎn)移酶合成及其活性降低，Tf的唾液酸化因此亦減少。將乙醛作用于正常鼠的高爾基體，同樣可見到SA轉(zhuǎn)移酶、半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和N-乙酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶減少。Fast等［4］研究SA轉(zhuǎn)移酶的作用時，發(fā)現(xiàn)N-糖苷酶部分降解N-糖苷后，活性降低;甲醇、乙醇可完全去糖基化，認為該酶失去催化活性與去糖基化升高有關(guān)，并推測SA轉(zhuǎn)移酶 (包括半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和N-乙酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶)活性降低，使Tf不完全糖基化，即乙醇及其代謝產(chǎn)物主要影響有關(guān)Tf糖鏈合成的糖基轉(zhuǎn)移酶的糖基化。

目前，轉(zhuǎn)鐵蛋白檢測的主要方法是等電聚焦法、陰離子交換層析法、色譜聚焦法、聚丙烯酞胺凝膠等電聚焦法，在不同的檢測設(shè)備、檢測方法和不同的人群，CDT值有所不同，其特異性、敏感性也有差別。

由于目前使用的Tf抗體不能識別CDT和Tf(既能與CDT結(jié)合，也能與Tf結(jié)合)，CDT特異性抗體尚未制備成功，所以本實驗利用凝集素親和層析技術(shù)分離血清中的CDT和Tf，然后用ELISA技術(shù)分別測定CDT和Tf。本實驗采用的凝集素是allo-A(Allomyrina dichotoma agglutinin)，能與含有 siaα26Galβ14GlcNAc殘基的寡糖結(jié)合［5］，在以allo-A凝集素建立的親和層析中，Tf與層析柱內(nèi)的allo-A凝集素結(jié)合而滯留于層析柱內(nèi)，CDT則在適宜的洗脫條件下可通過層析柱。除 Tf外，血清中其他含有 siaα26Galβ14GlcNAc殘基的糖蛋白也滯留在層析柱內(nèi)，所以在第二峰洗脫液中除了含有Tf外，還含有其他具有siaα26Galβ14GlcNAc殘基的糖蛋白。由于CDT缺失SA，以低親和力與Allo A結(jié)合，所以在第一峰洗脫液中含有CDT，除CDT外，還含有其他不能與Allo A結(jié)合的糖蛋白。綜上所述，兩組人員血清洗脫圖譜均呈現(xiàn)兩個主要洗脫峰;allo-A親和層析技術(shù)用于CDT的初步分離。

CDT定義及檢側(cè)標準化尚存在一些問題，由于Tf的微異質(zhì)性，CDT的分析依賴于其可靠地分離，從而用不同檢測、分析方法，不同的回收率，降低了CDT值的可比性及診斷可靠性。雖然我們檢測的結(jié)果，與文獻結(jié)果不盡相似，但通過比較CDT/Tf比值的變化，仍能說明CDT是診斷酒精性肝病良好的生化標志。

［1］HELENA STILBER.Carbohydrate-Deficient Transferrin in serum:a New Marker of Potentilly Harmful Alcohol Consumption Revirwed［J］.Clin chem，1991，37:20-29.

［2］中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組.酒精性肝病診療指南［J］.中華肝臟病雜志，2006，14(3):164-166.

［3］AMODT-T.Carbohydrate-deficient transferrin as a marker o-f chronic alcohol abuse:a critical rewiew of preanalysis，analysis，and interpretation ［J］.Clin Chem，2001，47(1):13-27.

［4］FAST DG，JAMIESON JC，MCCAFLREY G.The role of carbohydrate chains of Galβ1，4-GlcNAc a2 ，6 sialytransferase for eazyme activity［J］.Biochim Biophys Arta，1993，1202:325-330.

［5］KIYOSHI YOSHIRAWA，KAZUO UMETSU，HARUHIDE SHINZAWA，et al.Determination of carbohydrate-deficient transferrin separated by lectin affinity chromatography for detecting chronic alcohol abuse［J］.FEBS Letters，1999，458(2):112-116.