miR-214表達載體構建及其對靶基因β-catenin的調控

林述琨 王耀鵬 溫吉海

1.大連普蘭店市中心醫院病理科； 2.普蘭店市中心醫院肺外科

MicroRNAs(miRNA)是一類長約19～25bp的單鏈非編碼小分子RNA，能夠與靶 基因mRNA的3UTR以不完全互補的方式結合，在轉錄后水平上引起靶基因mRNAs發生降解或翻譯抑制[1,2]。近年研究發現miRNAs在多種人類腫瘤的發生發展中具有類似癌基因或抑癌基因的作用[3,4]。

研究報道miR-214可能參與多種腫瘤的發生和發展過程[5-8]；本研究發現miR-214在肺癌組織中表達明顯低于癌旁肺組織，同時我們構建了miR-214的真核表達載體，并通過雙熒光素酶報告分析和Western blot方法探討miR-214對靶基因的調控作用。從而為研 究miR-214在肺癌中作用機制提供了基礎。

1材料和方法

1.1細胞培養和轉染人肺腺癌細胞株A549，用含有10%新生牛血清，100U/ml的青霉素和100U/ml的鏈霉素的DMEM培養液在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養。當細胞生長至對數生長期后，按照lipo2000(Invitrogen公司)說明書的方法進行轉染。細胞轉染48h后提取細胞總RNA和蛋白進行后續相關實驗。

1.2 Real-time PCR用Trizol(Invitrogen公司)提取細胞總RNA后反轉錄為cDNA(Takara)。miR-214的反轉錄引物為5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA CTG CC-3′；real-time PCR引物序列：上游引物5′- GGA CAG CAG GCA CAG ACA -3′，下游引物5′- CAG TGC AGG GTC CGA GGT -3′。以U6為內參，反轉錄引物序列為5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA AAA TAT GGA AC-3′；real-time PCR引物序列：上游引物5′-TGC GGG TGC TCC GCT TCG GCA GC-3′，下游引物5′-CAG TGC AGG GTC CGA GGT-3′。使用SYBR Green(Takara)染料法進行反應，95℃預變性10 min，95℃變性5s，60℃退火34s，74℃熒光檢測3s，共40個循環。以2 值比較兩者之間的差異。每組重復設置3個復孔。

1.3 miR-214質粒的構建根據 miR-214前體在GenBank中的序列，設計PCR引物，引物序列為：Forward：5'- AAGCTTCTGTTACGCAAATTATCCATGTT -3'，Reverse：5'- CTCGAGAATGGGTTTTATTATATTTCATA-3'，目的片段亞克隆到pCDNA3.1(+)上，經Real-time PCR驗證重組質粒pCDNA3.1(+)-miR-214 能夠過表達成熟的miR-214。

1.4 雙熒光素酶報告基因檢測應用生物信息學預測軟件對miR-214進行靶基因預測，選β-catenin為候選靶基因，PCR擴增包括miR-214結合位點在內的β-catenin 3'UTR區，引物序列為：Forward：5'-AAT TGTAATCTGAATAAAGTGTAACAAT-3'，Reverse：5'-ATGAATTAAAAGTTTAATTCTGAACCAT-3'(引入SacI和XhoI 酶切位點，)， 目的片段亞克隆到 pMIR載體螢火蟲熒光素基因的下游，重組載體命名為pMIR-β-catenin。對pMIR-β-catenin重組質粒“種子區”進行定點突變，突變后的質粒命名為pMIR-βcatenin-Mut。所有構建的表達質粒均經雙酶切和測序鑒定。A549細胞在24孔板中培養，細胞融合度為80%左右時進行轉染，轉染分組為：pCDNA 3.1(+)-miR- 214+pMIR-β-catenin組、pCDNA3.1(+)+pMIR-β-catenin、pCDNA3.1(+)-miR- 214+pMIR-β-catenin-Mut組，每組設3個復孔。轉染后繼續培養48h，加入裂解液(100μl/孔)，離心并收集上清至96孔板中，每孔中加入40μl 螢火蟲熒光素酶底物，混勻10s后檢測熒光強度；然后再加入40μl海腎熒光素酶底物，混勻10s后檢測熒光強度。將螢火蟲熒光素強度值/海腎熒光素強度值進行標準化校正。

1.5 Western blot檢測β-catenin蛋白表達水平，用RIPA細胞裂解液(含有0.1%的PMSF)冰上裂解細胞20min，收集于1.5ml EP管中，離心后上清液轉移至無菌EP管中，BCA法測定蛋白濃度。取等量蛋白在SDS-PAGE中電泳，轉移到PVDF膜上；5%脫脂奶粉4℃過夜封閉，用β-catenin的兔抗人單克隆一抗(1:1000)室溫下孵育2 h(cell signaling 9581)，再用過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1:5000)室溫下孵育2h，以β-actin為內參，用Bandscan 5.0軟件分析蛋白條帶總灰度值，檢測表達差異。

1.6統計學方法應用SPSS 13.0統計學軟件進行統計學分析。采用t檢驗進行兩樣本間比較，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-214在肺癌組織中的表達情況為了驗證miR-214在肺癌中的表達情況，我們應用real-time PCR檢測了5對肺癌組織及相應癌旁肺組織中miR-214的表達。結果顯示，肺癌組織較癌旁肺組織miR-214明顯低表達，見圖1。

2.2 生物信息學預測β-catenin是miR-214的靶基因應用生物信息學預測軟件 TargetScan對miR-214的靶基因進行預測，分析顯示在β-catenin的3'UTR 區有7 個堿基與β-catenin 的“種子區”完全互補配對(見圖2)，因此生物信息學預測認為β-catenin可能是miR-214的靶基因。

圖1 Real-time PCR方法檢測miR-214的表達

圖2 生物信息學軟件預測miR-214的靶基因

2.3 雙熒光素酶報告基因分析miR-214對β-catenin的調控作用將重組表達載體pCDNA3.1-miR-214和融合β-catenin 3'UTR 的表達質粒pMIR-β-catenin共轉染A549 細胞后熒光素酶活性表達受到明顯的抑制，而轉染空載體pCDNA 3.1 和融合基因β-catenin'UTR的表達質粒pMIR-Aβ-catenin的熒光素酶活性無明顯的變化；同樣，轉染pCDNA3.1-miR-214和融合β-catenin 3'UTR“種 子 區 ”突 變 的 表 達 質 粒pMIR-β-catenin-Mut 共轉染A549細胞后熒光素酶活性沒有受到抑制，與對照組轉染空載體pCDNA3.1和融合基因β-catenin 3'UTR 的表達質粒的熒光素酶活性比較差異無統計學意義(見圖3)。結果表明miR-214 能夠對人β-catenin 3'UTR 區起到抑制性的調控作用。

2.4 Western blot檢測miR-214抑制內源β-catenin蛋白表達 pCDNA 3.1-miR-214轉染組中β-catenin蛋白表達與空白對照組(mock)和空載體轉染組(pCDNA 3.1)中β-catenin蛋白表達差異明顯，β-catenin在pCDNA 3.1-miR-214轉染組中表達明顯下調。結果表明miR-214能夠在翻譯水平上抑制β-catenin蛋白表達。

圖3 雙熒光素酶報告基因分析miR-214對β-catenin的調控

圖4 Western blot檢測β-catenin蛋白表達。1-空白對照組(mock)；2-空載體轉染組(pCDNA 3.1)；3-pCDNA 3.1-miR-214轉染組

3 討論

目前，miRNA是現今腫瘤學的研究熱點之一，miRNA可以與多種靶基因結合在腫瘤發生發展過程中可起到癌基因或抑癌基因作用[3,4]。研究報道miR-214可以抑制肝癌、宮頸癌和乳腺癌的侵襲和轉移[5-8]，起到抑癌基因作用。而目前miR-214在肺癌中的作用未見報道，現就miR-214在肺癌中的表達及靶基因進行了實驗研究。

我們首先檢測了肺癌和癌旁組織中miR-214的表達水平，發現miR-214在肺癌組織中表達明顯下調，miR-214可能作為抑癌基因參與肺癌的發生。進一步我們通過生物信息學軟件預測β-catenin可能是miR-214的靶基因，本研究首先通過雙熒光素酶報告基因證實miR-214對的β-catenin的3'UTR 區具有作用的基礎上，進一步在A549細胞中通過Western blot 方法證實了miR-214 對β-catenin的表達具有抑制作用。已有研究表明β-catenin的表達與肺癌的發生、轉移相關[9,10]。因此，本研究對深入探討miR-214 對β-catenin表達抑制作用的作用機理，為進一步研究miR-214在肺癌中的作用提供了思路和治療的靶點。

[1] ZHANG H,LI Y,LAI M.The microRNA network and tumor metastasis[J].Oncogene,2010,29(7):937-948.

[2] OCANA OH,NIETO MA.A new regulatory loop in cancer-cell invasion[J].EMBO Rep,2008,9(6):521-522.

[3] SANTARPIA L,NICOLOSO M,CALIN G A.MicroRNAs:a complex regulatory network drives the acquisition of malignant cell phenotype[J].Endocr Relat Cancer,2010,17(1):F51-75.

[4] VOORHOEVE PM.MicroRNAs:Oncogenes,tumor suppressors or master regulators of cancer heterogeneity?[J].Biochim Biophys Acta,2010,1805(1):72-86.

[5] C.C.Wong,C.M.Wong,E.K.Tung,et al.The microRNA miR-139 suppresses metastasis and progression of hepatocellular carcinoma by down-regulating Rho-kinase 2[J].Gastroenterolo gy,2011,140(1):322–331.

[6] Wang Y,Lee AT,Ma JZ,et al.Profiling microRNA expression in hepatocellular carcinoma reveals microRNA-224 up-regulation and apoptosis inhibitor-5 as a microRNA-224-specific target[J].J Biol Chem,2008,283(19):13205–13215.

[7] Yang Z,Chen S,Luan X,et al.MicroRNA-214 is aberrantly expressed in cervical cancers and inhibits the growth of HeLa cells[J].IUBMB Life,2009,61(11):1075-1082.

[8] Derfoul A,Juan AH,Difilippantonio MJ,et al.Decreased microRNA-214 levels in breast cancer cells coincides with increased cell proliferation,invasion and accumulation of the Polycomb Ezh2 methyltransferase[J].Carcinogenesis,2011,32 (11):1607–1614.

[9] Yang LH,Xu HT,Han Y,et al.Axin downregulates TCF-4 transcription via beta-catenin,but not p53,and inhibits the proliferation and invasion of lung cancer cells[J].Mol Cancer,2010,2;9:25-30.

[10] Chiu CG,Chan SK,Fang ZA,et al.Beta-catenin expression is prognostic of improved non-small cell lung cancer survival[J].Am J Surg,2012,203(5):654-659.