應用siRNA干擾下調CDX2表達以增強人胃癌SGC-7901細胞對5-Fu的敏感性

金雅磊 徐 理 李 春 葉旭軍 袁 勝 王 樺 夏 冰

1.武漢大學中南醫院綜合科；2.湖北省軍區武昌珞咖山離職干部休養所

我國胃癌發病率高，其死亡率又占各種惡性腫瘤之首位[1]。胃癌早期診斷率較低，進展期和中晚期胃癌手術年生存率低，因此臨床上的化療對胃癌的治療具有重要意義[2]。5-氟尿嘧啶(5-Fu)是目前臨床上最常用的化療藥物之一，但長期應用后容易出現耐受現象。多藥耐藥(MDR)是胃癌化療失敗的重要原因之一[3]。

Caudal type no-meobx transcription factor 2(CDX2)是最近發現的特異性核轉錄因子，在正常生物發育過程中，CDX2對消化道的發育起著關鍵的作用[4]。近年來研究發現，CDX2基因過表達是胃癌[5-7]發生發展中的關鍵因素之一，提示該基因可作為一個候選的腫瘤轉移抑制基因。最近研究發現過度表達的CDX2通過增強啟動子區域的活性促進MDR1的大量表達[8]，從而產生化療藥物的耐藥性。因此我們推測降低胃癌細胞中的CDX2表達也許可以增強胃癌細胞對5-Fu的藥物敏感性。本研究擬通過檢測CDX2基因沉默能否增強胃癌細胞5-Fu化療敏感性，從而為胃癌的化療開辟新途徑。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 RPMI-1640粉劑(美國Gibco BRL公司)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、Triton-X-100(Biorad公司)、鼠抗人CDX2單克隆抗體購自美國BIOGenex公司，5-Fu購自江蘇豪森藥業公司，針對CDX2基因的siRNA和陰性對照siRNA均為為上海吉瑪制藥技術有限公合成，其中陰性對照siRNA為對CDX2基因無干擾作用的雙鏈RNA，四甲基偶氮唑藍(MTT)購自美國Sigma公司。其余均為國產分析純試劑。

1.1.2 細胞株 人胃癌細胞SGC-7901由武漢大學培養中心提供，用含有100 mg/L胎牛血清、100 ku/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPM1640培養基，在37℃、飽和濕度及50 ml/L CO2的細胞培養箱內傳代培養。

1.2 方法

1.2.1 試驗分組 實驗分為5組：空白對照組、脂質體組、5-Fu組、siRNA組和5-Fu+siRNA聯合組；每組設5個復孔。

1.2.2 細胞轉染

1.2.2.1 寡核苷酸序列 針對人類CDX2基因mRNA序列中位點(NCBI GenBank，基因編號：NM-001265)，利用 “siRNA Target Finder Tool”(Genscript公司)設計軟件，靶向CDX2基因siRNA寡核苷酸由上海生工公司化學合成，寡核苷酸序列見表1。

1.2.2.2 操作過程 用T4DNA連接酶將雙鏈寡核苷酸與Psilencer2.1線性載體定向連接后轉化大腸桿菌DH5а，植入固體LB培養液。挑選氨芐青霉素抗性菌落并擴增培養。將1×105個SGC-7901細胞接種于6孔板，其融合達90% 時分別用Psilencer2.1陽性重組子和對照陰性重組子進行轉染。轉染48 h后按1∶10稀釋傳代并換用選擇培養液(600 mg/L，G418)繼續培養14 d，然后將出現的細胞克隆在培養瓶中擴增培養并傳代建系，分別命名為SGC-7901/Silence(+)和SGC-7901/Silence(－)細胞。

表1 寡核苷酸序列

1.2.3 Western blot方法檢測 CDX2基因蛋白表達 收集各組細胞，洗滌、裂解液后低溫離心5分鐘，取上清，Forlin酚法測蛋白濃度。進行12.5%Tris一甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠和5%的積層膠電泳、轉膜、封閉。分別加入一抗兔抗人CDX2及β-actin多克隆抗體，4℃孵育過夜，堿性磷酸酶標記羊抗兔IgG孵育2h，四唑硝基藍(NBT)/5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽(BCIP)顯色。一抗及二抗濃度均為l:1 000，用圖像分析系統測定各條帶的灰度值，并用Image J圖像分析軟件分析。以β-actin為內參，表示CDX2蛋白的相對表達強度。

1.2.4 免疫熒光顯微鏡檢測細胞凋亡形態 我們使用免疫熒光顯微鏡對篩選出的表達CDX2 shRNA和Nonsilence shRNA的SGC-7901細胞進行檢測。

1.2.5 MTT法檢測細胞增殖抑制率 按同前實驗分組，各組設5個復孔，分別收集轉染前和轉染后的細胞，按每孔1×104個細胞接種于96孔培養板，細胞貼壁后，根據分組加入所需試劑及藥物。72 h后，每孔加入10μl的MTI'，繼續培養4h，棄上清，加150μl的二甲基亞砜(DMSO)室溫振蕩10 min后570nm波長處測定光密度值(D570)。細胞抑制率(%)=(1-D570處理組／D570對照組)×100%。

1.2.6 統計學方法 采用SPSS 11.0軟件完成，比較兩組之間數值的差異用t檢驗，多組之間則用方差分析。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1免疫熒光顯微鏡檢測細胞凋亡形態圖1顯示，CDX2 knockdown組較non-silence組的細胞的綠色熒光平均強度明顯減弱。

2.2 轉染CDX2siRNA的SGC-7901對5-Fu敏感性的影響。 MTT法檢測發現后三組(包括單用5-Fu組、轉染siRNA組和5-Fu+轉染siRNA聯合組)對SGC-7901細胞的增殖有明顯抑制作用，其中5-Fu+轉染siRNA聯合組抑制率最高，后三組與空白對照組比較差異具有統計學意義P<0.05，見表2。

圖1 免疫熒光顯微鏡檢測表達不同siRNA的SGC-7901細胞表面CDX2蛋白的表達水平。

表2 CDX2 siRNA對SGC-7901細胞增殖的抑制作用(n=5,x±s,%)

2.3 CDX2蛋白的表達Wstern Blot法檢測顯示，5-Fu組、轉染組和聯合組CDX2蛋白的表達均下調，明顯低于其余各組(P<0.05)，見表3。

表3 各組SGC-7901細胞中CDX2蛋白的表達(n=5,x±s,%)

圖2 各組CDX2蛋白表達(Western-blot ECL圖像)

3 討論

我國胃癌發病率高，其死亡率居各種惡性腫瘤之首[1]，目前在胃癌患者的治療中，許多患者由于主、客觀原因失去了手術的機會。胃癌的化療常需聯合應用多種藥物以提高療效，然而對化療藥物產生耐藥性的患者逐年增多，且化療藥物對人體正常組織的不良反應較大，這些情況依然是導致胃癌患者化療失敗的主要原因[2]。因此，為解決這些難題，研究對胃癌細胞更有選擇性的新型治療方法已成為當務之急。siRNA應用于抑制胃癌細胞不僅能提供一種經濟、快捷、高效的抑制基因表達的技術手段，而且有可能在基因功能測定和基因治療等方面開辟一條新思路，因此包括動物醫學在內的諸多領域的應用也有非常廣闊的前景。

CDX2是一種新發現的特異性的核轉錄因子，是尾型同源框基因家族中的一員[4]；是最近發現的特異性核轉錄因子。最早由Mlodzik于果蠅中分離成功，發現與Parahox家族呈高度的同源性[1]。近年來人類的染色體研究表明，CDXZ基因全長22～23kb，位于染色體的13q12-13，由3個外顯子和2個內含子構成；與之對應的CDX2蛋白包含311個單氨基酸，通過螺旋一環一螺旋的方式結合于DNA的相應區域，以轉錄因子的形式調節DNA的表達。近年來，CDX2基因與胃癌的關系已逐步得以闡明。Camilo V[5]報道在胃腺癌細胞CDX2 mRNA和蛋白的表達均顯著升高。Peleteiro B等[6]對270例胃癌研究后發現，80.0%的胃癌組織表現不同程度的CDX2陽性表達。研究發現，CDX2基因過表達與胃癌生長、轉移生物行為的研究有關，通過CDX2基因沉默可以抑制胃癌生長[7]。我們的研究通過將CDX2特異性siRNA轉染入SGC-7901細胞中，發現轉染siRNA組和5-Fu+轉染siRNA聯合組中的CDX2蛋白表達減少，SGC-7901細胞的增殖也有明顯抑制。我們的試驗從蛋白水平驗證轉染CDX2 siRNA的干擾效果；也提示轉染CDX2 siRNA聯合5-Fu可以降低胃癌細胞的耐藥性，提高化療效果，從而為臨床治療胃癌提供了新思路。

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[5] Camilo V,Barros R,Sousa S,et al.Helicobacter pylori and the BMP pathway regulate CDX2 and SOX2 expression in gastric cells[J].Carcinogenes is,2012,33(10):1985-1992.

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