生存素和血管生成素2的表達在乳腺癌淋巴轉移中的作用

李湘奇

（泰山醫學院 附屬醫院，山東 泰安271000）

乳腺癌死亡的主要原因是原發灶的廣泛播散，而腋窩淋巴結常是廣泛轉移的第一步，因此淋巴結轉移情況往往成為評價乳腺癌患者預后和選擇治療方式的主要標準之一［1］。生存素（Survivin）是一種凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP），在人胚胎組織中高度表達并參與胚胎發育過程中的組織分化和器官形成，在分化成熟的成人組織中檢測不到，卻廣泛表達于人類的多種腫瘤組織。有研究表明Survivin不僅表達于癌組織，還表達于許多癌前疾病組織中［2］，具有抑制凋亡和調節細胞增殖的雙重功能。乳腺上皮細胞發生癌變后，癌組織的進一步生長依賴于局部微血管與淋巴管的發生，在腫瘤淋巴管生成過程中，血管生成素2（angiopoietin2，Ang2）發揮了重要的作用［3］。但是 Ang2及Survivin在乳腺癌組織中的表達與淋巴轉移的相互作用的機制尚不完全明確。本研究采用免疫組化方法和逆轉錄聚合酶鏈反應（RT－PCR）檢測乳腺癌組織Survivin、Ang－2蛋白和基因的表達情況，分析它們與乳腺癌臨床病理學特征的關系，探討其表達對乳腺癌淋巴轉移的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料 收集泰山醫學院附屬醫院2007年1月—2009年12月經HE染色病理診斷的乳腺癌［4］術后標本，60例均為女性，平均年齡43.6（27－66）歲。其中浸潤性導管癌54例，浸潤性小葉癌1例，髓樣癌4例，浸潤性導管癌伴鱗癌1例。有淋巴結轉移32例，無淋巴結轉移28例。所有患者術前均未接受放療或化療。參照國際抗癌聯盟（international union against cancer，UICC）和美國癌癥聯合會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）合作制定的腫瘤TNM 分期［5］，Ⅰ期11例，Ⅱ期38例，Ⅲ期11例。從60例手術標本中選取經病理診斷為乳腺浸潤性導管癌［4］新鮮標本23例，其中無淋巴結轉移組11例，有淋巴結轉移組12例，標本取約1.2cm3裝入凍存管中，迅速放入－70℃冰箱內保存備用。標本的收集報請泰山醫學院附屬醫院醫學道德倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑 兔抗人Survivin多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司，北京），鼠抗人Ang－2單克隆抗體、胰蛋白酶、鏈霉卵白素－過氧化物酶 （streptavidin－horseradish peroxidase，S－P）試劑盒（sp－9001）及濃縮型DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，北京）。一步法RT－PCR試劑盒（天根生化科技有限公司，北京），Trizol試劑為Invitrogen公司產品，RT－PCR引物由Invitrogen（上海）公司合成；化學發光劑為Santa Cruz公司產品，預染色的蛋白Marker購自Solarbio公司。

1.2 檢測方法

1.2.1 免疫組織化學法檢測Survivin及Ang 2蛋白的表達 石蠟標本脫蠟重新包埋，以恢復抗原性，切片厚4μm，采用免疫組織化學S－P法（步驟按說明書進行），每次實驗以已知Survivin、Ang2陽性切片（由試劑公司提供）作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。經DAB顯色，蘇木精對比染色后封片，于48h內光學顯微鏡下閱片。

結果判斷：Survivin定位于胞漿，為黃色至棕黃色顆粒；Ang－2以腫瘤細胞胞質出現棕黃色顆粒為陽性細胞。每一切片隨機選擇3個視野，在顯微鏡（×400）下計數每個視野100個腫瘤細胞中陽性細胞的比例，取3個視野的平均百分數為判定結果。評分標準參照文獻［6］適當修改：陽性細胞數≤5%為0分；＞5%－25%為1分；＞25%－50%為2分；＞51%－75%為3分；＞75%為4分。染色強度：0分為無染色；1分為淡黃色；2分為黃色；3分為棕黃色。免疫組織化學結果根據染色陽性細胞數和染色強度分別評分，兩者乘積0－1分為陰性（－）；2－3分為陽性（＋～＋＋）；4分以上為強陽性（＋＋＋）。

1.2.2 RT－PCR法檢測Survivin及 Ang2mRNA的表達 經病理診斷為乳腺浸潤性導管癌23例新鮮標本，采用Trizol法提取組織總RNA，每例取總RNA 2μg進行逆轉錄聚合酶鏈反應，同時擴增B2M（bet－2microglobulin）作為內參照，每個標本至少重復3遍。內參引物序列F：5′－GGC TAT CCA GCG TAC TCC AAA－3′，R：5′－CGG CAG GCA TAC TCA TCT TTT－3′，產物長度246bp；Ang－2引物F：5′－CGC CGC TCG AAT ACG ATG－3′，R：5′－CGT CTG GTT CTG TAC TGC ATT－3′，擴增產物片段為158bp；Survivin引物 F：5′－CCC TGC CTG GCA GCC CTT TCA－3′，R：5′－CTG GCT CCC AGC CTT CCA－3′擴增片段長度 188bp。50℃30min逆轉錄合成cDNA，95℃15min預變性后開始循環：94℃45s，52℃－58℃45s，72℃1 min，共35個循環，最后于72℃延伸10min。擴增產物在2.0%瓊脂糖凝膠上電泳分離，紫外透射儀下拍照。陰性結果為Marker相應分子量位置無電泳條帶，陽性結果為目的條帶出現在相應的Marker分子量位置。

1.3 統計學處理

采用SPSS 17.0統計分析軟件，對實驗數據進行χ2檢驗及直線（等級）相關分析。根據資料類型分別做行×列表χ2檢驗，四格表χ2檢驗，確切概率法，Spearman相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Survivin和Ang2在乳腺癌組織中的表達

60例乳腺癌標本中，Survivin陽性表達率為85.0% （51／60），Ang2陽性表達率為73.3%（44／60）。淋巴結陽性組的Survivin表達率96.9%（31／32）明顯高于淋巴結陰性組表達率71.4%（20／28）（χ2＝5.72，P＝0.02）。淋巴結陽性組的Ang2表達率87.5% （28／32）明顯高于淋巴結陰性組Ang2的表達率57.1% （16／28）（χ2＝7.04，P＝0.008）。Survivin和Ang2表達與乳腺癌大小、組織分型無關（P＞0.05）（表1）。

2.2 Survivin與Ang2在乳腺癌中表達的相關性

通過對臨床資料的分析，Survivin陽性表達組中 Ang2的表達為74.5%（35／51），Survivin陰性表達組中Ang2的表達為66.7%（6／9），經直線相關分析，Survivin與Ang2在乳腺癌中的相關系數r＝0.32，呈正相關（P＝0.01，表2）。

表1 Survivin、Ang2表達與乳腺癌臨床病理的關系例（%）

2.3 Survivin和Ang2mRNA在乳腺癌組織中表達

23例乳腺癌新鮮標本中，Survivin mRNA在淋巴結轉移的乳腺浸潤性導管癌組織中表達高于無淋巴結轉移組，兩組間比較差異有統計學意義（P＝0.027）。Ang2mRNA在兩組乳腺浸潤性導管癌組織中表達水平差異有統計學意義（P＝0.037），（表3，圖1）。

表2 Survivin與Ang2在乳腺癌中表達的相關性

表3 Survivin和Ang2mRNA在乳腺癌組織中的表達

圖1 乳腺浸潤性導管癌組織中Survivin和Ang2mRNA的表達

3 討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，在歐美國家高發，我國近年來乳腺癌發病率也呈現快速上升趨勢［7］，成為我國近年來城市中癌癥死亡率上升最快的腫瘤，防治具有重要的價值與意義。survivin是凋亡抑制蛋白家族中一個結構特殊的成員，參與調控調亡和細胞分裂，具有抑制凋亡和調節細胞增殖的雙重功能［8］。Survivin在正常組織中不表達或低表達，在腫瘤組織中呈特異性表達，與腫瘤細胞凋亡的喪失、腫瘤的發生有密切的關系，且Survivin的表達往往與上述腫瘤的惡性程度、預后不良等呈正向關系［9］。Tan等［10］研究結果發現，survivin可有效維持微小血管網結構，促進血管內皮生長因子對內皮細胞的保護功能，抵抗化療藥物對內皮細胞的誘導凋亡作用。本研究60例乳腺癌標本中，Survivin陽性表達率為85.0% （51／60），淋巴結陽性組的Survivin表達率96.9% （31／32）明顯高于淋巴結陰性組表達率 71.4%（20／28）（χ2＝5.72，P＝0.02）。提示survivin可能通過抑制乳腺癌細胞凋亡，在乳腺癌的發生、發展過程中起重要作用。另外，我們發現survivin在發生淋巴結轉移的乳腺癌組織中的表達明顯高于其在無淋巴結轉移乳腺癌組織中的表達，在浸潤性導管癌和其他癌的病理類型中的表達以及TNM各分期中的表達無明顯差異（P＞0.05），survivin表達與乳腺癌大小、組織分型無關（P＞0.05）。提示survivin蛋白在乳腺癌細胞的轉移、侵襲等活動中可起到促進作用。腋窩淋巴結是否轉移是關系到乳腺癌治療及預后的一個獨立指標，發生腋窩淋巴結轉移的乳腺癌提示預后相對較差，那么我們可以推測survivin可能是乳腺癌預后不良的指標。

血管生成素是近年來發現的重要的血管生成調控因子，其家族成員Ang1和Ang2分別于1996年及1997年相繼被發現，它們的共同受體是Tie－2（酪氨酸激酶受體－2）［11］。Ang1能夠促進血管內皮細胞出芽，促進血管重塑、成熟，維持血管的完整性，具有穩定血管的作用。而Ang2的功能主要是通過競爭性抑制Ang1與受體Tie－2結合，使血管內皮細胞同周圍的支持細胞發生解離，形成不穩定滲漏性的血管，從而促進腫瘤血管的重構與形成［12］?，F在已有大量研究表明，Ang家族與腫瘤淋巴管生成密切相關，乳腺腫瘤患者血漿中Ang2表達水平明顯增高，提示Ang2與乳腺病變的良惡性有關，而且可能成為臨床上判斷乳腺腫瘤生物學行為的指標之一［13］。但是，目前還沒有對 Ang／Tie－2在人淋巴管新生過程中的調節作用做直接和深入的研究。但已有的研究發現Ang／Tie－2系統對淋巴管的發育和生長也有重要影響，剔除Ang2基因的小鼠發生淋巴管發育缺陷，出現乳糜腹水，說明Ang2對于正常淋巴管的形成和穩定是必需的［14］。Sfiligoi等［15］研究發現，Ang－mRNA的表達水平與淋巴結轉移呈顯著相關，并和腫瘤微血管密度密切相關。由此推測，在腫瘤淋巴管生成過程中，Ang2發揮了重要的作用。但是，也有學者從動物實驗模型中發現Ang2主要介導淋巴管成熟［16］?？梢夾ng2在腫瘤的淋巴管生成中起非常重要的作用。

本組研究顯示：Ang2陽性表達率為78.3%（47／60），淋巴結陽性組的 Ang2表達率90.6% （29／32）明顯高于淋巴結陰性組Ang2的表達率64.3%（18／28）（χ2＝6.10，P＝0.01），提示 Ang2的陽性表達與乳腺癌淋巴轉移關系密切。說明Ang2在乳腺癌的淋巴管生成和淋巴轉移中起著重要的作用，但在浸潤性導管癌和其他癌的病理類型中的表達以及TNM各分期中的表達無明顯差異（P＞0.05），提示Ang2表達與乳腺癌大小、組織分型無關（P＞0.05）。

RT－PCR結果顯示，Survivin mRNA及 Ang2 mRNA在淋巴結轉移的乳腺浸潤性導管癌組織中表達高于無淋巴結轉移組，Survivin mRNA及Ang2mRNA與乳腺癌淋巴轉移顯著相關（P＜0.05），Survivin與Ang2共同促進乳腺癌的淋巴轉移。進一步研究結果顯示，在乳腺癌組織中Survivin與Ang2的表達呈正相關，兩者均與乳腺癌的淋巴轉移關系密切。因而推測Survivin在乳腺癌中的表達上調可能促使乳腺癌細胞Ang2的過表達，通過Ang／Tie－2信號系統作用于內皮細胞，誘導淋巴管生成，從而促進淋巴轉移的發生。

綜合本實驗結果推測，在乳腺浸潤性導管癌的淋巴轉移中Survivin與Ang2可能在起共同的作用。其機制可能是Survivin抑制了乳腺癌細胞的凋亡，直接或間接促進Ang2蛋白的表達，進而促進淋巴管內皮細胞生長和乳腺癌發生淋巴結轉移。但是Survivin通過什么途徑促進了Ang2表達，由于本研究的標本較少，存在一定的局限性，需要進一步的體內外相關實驗證實。

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