長效土霉素注射液在豬體內的藥動學及相對生物利用度研究

廖雪玲，張炳旭，丁煥中

(1.上海公誼獸藥廠，上海 201401;2.華南農業大學獸醫學院，廣州 510642)

四環素類抗生素用于治療感染性疾病已有半個世紀。由于口服給藥的方便性，四環素類抗生素臨床實踐具有廣泛的使用性[1]。此類抗生素是通過抑制蛋白質的合成來抑制細菌生長，其機制是藥物與細菌30s亞基核糖體結合，從而阻止氨基酰-tRNA結合到核糖體的A位點，進而阻止氨基酸多肽鏈的合成[2]。

土霉素為四環素類廣譜抗生素，20世紀50年代開始用于臨床，對革蘭氏陽性菌、陰性菌、立克次體、衣原體、霉形體、螺旋體、放線菌和某些原蟲皆有抑制作用[3]。土霉素不僅廣泛用于畜禽，還有少數被批準用于水產的抗生素，療效顯著[4]。美國于20世紀80年代推出長效土霉素注射液，抗菌效果顯著延長。近年來國內也有長效土霉素注射液相關研究，報道了不同溶媒的土霉素注射液在動物體內的藥代動力學特點[5]。本文對一種長效土霉素注射液在豬體內的藥動學和相對生物利用度進行研究，以期為臨床合理使用該劑型提供理論依據和指導。

1 材料與方法

1.1 試劑和藥品 30%長效土霉素注射液，批號071012，上海公誼獸藥廠。20%長效土霉素注射液，批號70453009E，美國輝瑞(動物保健品)有限公司。土霉素標準品，購自中國獸醫藥品監察所，批號H010105。EDTA·2Na、草酸、三氟乙酸、檸檬酸、高氯酸、85%磷酸、磷酸氫二鈉等均為國產分析純試劑。甲醇、乙腈均為色譜純，DIMA TECHNOLOGY INC。超純水為符合 GB/T6682規定的二級水。

1.2 儀器 高效液相色譜儀:Waters 2695分離系統、在線負壓脫氣機、2487紫外檢測器，配備四元泵、脫氣泵、色譜工作站、自動進樣器和柱溫箱，美國Waters公司。色譜柱:Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，不銹鋼柱，大連依利特公司。電子分析天平，FA2004N型，上海精密科學儀器有限公司。臺式高速離心機，Centrifuge5804，德國 EPPENDORF公司。旋渦混合器，XW-80A，上海青浦滬西儀器廠。可調微量移液器，Eppendorf Research型，10 ～100 μL，20 ～200 μL，100 ～1000 μL，500 ～5000 μL，德國 EPPENDORF 公司。

1.3 試驗動物 健康長白×大白×杜洛克三元閹公豬(landrace×large white×duroc)7頭，50日齡，體重(19.17±2.15)kg。自由采食、飲水，飼喂不加任何抗菌藥物的全價配合飼料。

1.4 給藥及采樣 動物按隨機交叉試驗設計進行分組。按20 mg/kg體重單次頸部肌肉注射30%長效土霉素注射液和對照土霉素注射液 (市售美國輝瑞20%長效土霉素注射液)。給藥前測定兩種制劑的藥物含量。給藥前采取空白血漿，給藥后0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、168、192 h 分別經前腔靜脈采集血液樣品，每次采血5 mL左右，分離血漿，-20℃保存待測。

1.5 樣品處理 樣品解凍，搖勻。準確吸取1.0 mL血漿，加入200 μL的變性劑(EDTA-Mcllvaine緩沖液和高氯酸的混合液，體積比4∶1)，漩渦30 s，混勻，靜置5 min后12000 r/min離心15 min，吸取上清液經0.22 μm針式濾膜過濾，取50 μL濾液進行高效液相色譜分析。

1.6 色譜條件 流動相:A液(含0.6 mmol/L EDTA·2Na，10 mmol/L 草酸，0.15%三氟乙酸)∶B液(乙腈)=70∶30(V/V);色譜柱:Hypersil BDS C18不銹鋼柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);進樣量20 μL;流速1.0 mL/min;柱溫35℃;紫外檢測波長357 nm。

1.7 回收率和變異系數 將定量的標準液加入豬空白血漿中，配得低(0.1 μg/mL)、中(0.5 μg/mL)和高(2 μg/mL)三個樣品濃度，按1.5項樣品處理方法處理樣品，進行HPLC測定;同時分別取濃度為0.1、0.5、2 μg/mL土霉素標準系列溶液1 mL進行HPLC測定，每一濃度樣品重復5次，以峰面積比計算，求其回收率。每批(日內)作5次重復，共作5個批次(日間)。計算每批內和每批間的色譜峰面積平均值及標準誤，求得各變異系數。

1.8 標準曲線和線性范圍 在2 mL的離心管中各加入1 mL空白血漿，再依次加入20 μL土霉素系列濃度(2.5～500 μg/mL)，旋渦混勻，使得各樣品中血漿的藥物濃度為0.05～10 μg/mL，按1.5項樣品處理方法處理樣品，進行HPLC測定。以土霉素色譜峰面積(A)為橫坐標，藥物濃度(C)為縱坐標，繪制標準曲線，求得標準曲線回歸方程和相關系數。

1.9 樣品測定及數據處理 給藥后不同時間點采集的血漿樣品經處理后，進行HPLC測定。以測得樣品中藥物峰面積代入標準曲線，計算藥物濃度。所得藥物濃度-時間數據采用MCPKP藥動學計算機程序處理，計算出每頭動物的藥動學參數，然后計算平均值及標準差。

2 結果

2.1 色譜條件適用性 在本試驗色譜條件下，土霉素與其他組分分離良好，色譜峰峰形較佳，測得土霉素保留時間為6.2 min左右。

2.2 回收率和變異系數 按上述處理方法，在0.1、0.5、2.0 μg/mL 濃度下，平均回收率在(77.4±2.3)% ～(96.4±2.4)%之間，批內和批間變異系數均不超過10.00%。由此可知，此血漿處理方法和液相檢測方法可靠，重復性好。

2.3 標準曲線和線性范圍 血漿中土霉素線性回歸方程為 C=0．000042A-0．0144(r=0.9999)，線性范圍為0.05～10 μg/mL。按信噪比S/N=3為檢測限(LOD)，S/N=10為定量限(LOQ)，求得本方法測定血漿中土霉素檢測限為0.02 μg/mL，定量限為0.05 μg/mL。

2.4 血藥濃度和主要藥動學參數 30%長效土霉素注射液與20%長效土霉素注射液藥動學試驗的血藥濃度和主要藥動學參數見表1和表2。土霉素在豬體內符合一級吸收二室模型。

表1 30%長效土霉素注射液與20%長效土霉素注射液給藥后的血藥濃度 μg/mL

續表

表2 30%長效土霉素注射液與20%長效土霉素注射液給藥后的主要藥動學參數(x±s)

3 討論

豬肌肉注射30%長效土霉素注射液后吸收迅速(吸收半衰期為0.088 h，達峰時間為0.609 h)，峰濃度高(4.956 μg/mL)，消除半衰期長(52.499 h)，有效血藥濃度維持時間長(給藥后72 h平均血藥濃度約為0.3 μg/mL)，相對生物利用度高(105.368%)。生物學統計結果表明(t檢驗)，與20%長效土霉素注射液相比，30%長效土霉素注射液給藥后主要藥動學參數(吸收半衰期、消除半衰期、峰濃度、達峰時間、藥-時曲線下面積)無顯著差異。

本試驗長效土霉素注射液在豬體內消除半衰期(t1/2β)為52.499 h，這與之前報道長效土霉素注射液在豬體內的消除半衰期(t1/2β)大致相符[6-7]。另外，長效土霉素在其他種類動物消除半衰期(t1/2β)為:山羊，15.1 h;綿羊，14.4 h;犢牛，23.9 h;奶牛，6.964 h(乳汁);奧尼羅非魚，60.312 h;班節對蝦，23.372 h[8-11]。由此可見，長效土霉素藥動學特征雖存在種屬差異性，但半衰期都相對延長，具有長效特點，這與土霉素使用的有機溶媒有關。早有研究報道，使用α-吡咯烷酮、二甲基乙酰胺為溶媒的土霉素注射液明顯具有長效性[12]。

本試驗按20 mg/kg體重給藥后，72 h平均血藥濃度約為0.3 μg/mL，高于豬的常見敏感菌MIC。因此，對于臨床敏感菌感染，建議30%長效土霉素注射液按20 mg/kg體重劑量3～4 d給藥1次，連續給藥2次，重癥酌情加倍。

[1]David M Shlaes.An update on tetracyclines[J].Current opinion in investigational drugs，2006，7(2):167-171.

[2]Bryskier A.Tetracyclines.In:Bryskier A(ed)Antimicrobical agents:antibactericals and antifungals[M].Washington，DC:ASM Press，2005:642-651.

[3]朱模忠.獸藥手冊[M].北京:化學工業出版社，2002:70-72.

[4]Topic Popovic N，Howell T，Babish J G，et al.Cross-sectional study of hepatic CYP1A and CYP3A enzymes in hybrid striped bass，channel catfish and Nile tilapia following oxytetracycline treatment[J].Research in Veterinay Scinece，2012，92(2):283-291.

[5]班付國，吳寧鵬，彭 麗，等.五種土霉素注射液在豬體內的藥物代謝動力學比較研究[J].中國獸藥雜志，2012，46(1):16-18.

[6]蔡金華，顧 欣，劉雅妮，等.高效液相色譜法測定豬血漿中多西環素的含量[J].中國獸藥雜志，2005，39(11):11-13.

[7]鮑 杰，丁雙陽.土霉素在豬體內的藥代動力學試驗[J].中國獸醫雜志，2011，47(3):88-90.

[8]魏占勇.長效土霉素注射液的研究進展[J].中國獸藥雜志，2003，37(10):47-49.

[9]楊大偉，孫永學，嚴 楚，等.土霉素在奶牛子宮內膜炎乳中的藥動學試驗[J].中國獸醫雜志，2008，44(10):90-91.

[10]丁相滿，張其中，葉柏喜，等.土霉素在奧尼羅非魚體內的藥動學研究[J].淡水漁業，2009，39(1):63-67.

[11]孫貝貝，胡琳琳，房文紅，等.土霉素在斑節對蝦體內藥代動力學和生物利用度[J].中國獸醫學報，2011，31(11):1653-1659.

[12]徐士新，郭文林，仲 鋒.土霉素注射液在豬體內藥代動力學比較[J].中國獸藥雜志，1998，32(1):10-13.