利用響應面分析法優化鼠李糖乳桿菌產胞外多糖的發酵工藝

任大勇，章檢明，曹 婧，劉宏鋒，焉慧潔，楊嫦娥，秦艷青，沈明浩

(1.吉林農業大學食品科學與工程學院，長春 130118;2.吉林大學畜牧獸醫學院，長春 130062)

胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)是由多數細菌與少數酵母菌及絲狀真菌在生長代謝過程中分泌到細胞壁外的水溶性多糖，按其結構可分為同多糖(由一種單糖構成)和雜多糖(由兩種以上單糖構成)[1]。EPS對微生物本身具有重要功能，如保護細胞免受脫水損傷以及噬菌體吞噬、為微生物提供營養、穩定細胞滲透壓、增加菌體對腸黏膜的黏附性、參與細胞信號傳遞等[2]。

乳酸菌(Lactic acid bacterium，LAB)是公認的食品級微生物(GRAS)，具有多種生理功能，與其他細菌相比，乳酸菌分泌的EPS安全性更高，以腸膜明串珠菌(L．mesenteroides)開發的右旋糖酐已得到廣泛應用[3]。近幾年，新的乳酸菌EPS的開發與研究成為熱點，產EPS的菌株主要有乳桿菌、乳球菌、鏈球菌、明串珠菌屬、雙歧桿菌等菌屬[4]。乳酸菌EPS是由有分支或無分支的重復單元組成，每個重復單位中含有3～8個單糖或單糖衍生物，通常是D-葡萄糖、D-半乳糖和L-鼠李糖，有時在重復單元中也會出現其他己糖和戊糖。現有研究證明，EPS具有多種重要的生理功能，如抗腫瘤、降膽固醇、增強機體免疫功能等[5-6]。

雖然乳酸菌EPS應用前景廣闊，但其產量較低，應用受到了一定的限制。因此，提高EPS的產量成為目前研究的熱點。通過篩選優良菌種，優化發酵條件，或對菌種進行改良可以在一定程度上提高胞外多糖的產率。其中，優化發酵條件(培養基成分和生長條件)是提高EPS產量的重要途徑[7]。響應面分析法(Response surface methodology，RSM)是通過對響應面等值線的分析尋求最優工藝參數，采用多元二次回歸方程來擬合多種因素與響應值之間函數關系的一種統計方法[8]。RSM廣泛應用于優化微生物培養基和提取工藝等方面。本研究以前期篩選的產EPS的鼠李糖乳桿菌為對象，以培養溫度、培養時間、pH、培養基組成(酵母粉、檸檬酸氫二銨、磷酸氫二鉀)和接種量為因素進行優化實驗。通過Plackett-Burman法從眾多因素中篩選出影響EPS產量的三個重要因素，再用Box-Behnken法建立響應面模型，以獲得最高的EPS產量。

1 材料與方法

1.1 試劑與菌種 主要試劑:酵母粉、檸檬酸氫二銨、磷酸氫二鉀、三氯乙酸、無水乙醇、聚乙二醇(PEG 20000)、苯酚、葡萄糖、濃硫酸。菌種:鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)，由吉林農業大學食品學院毒理學教研室保存。

1.2 培養基 MRS培養基:蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏8.0 g/L、酵母粉4.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L、檸檬酸氫二銨2.0 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳0.04 g/L、吐溫-80 1.0 mL。

1.3 材料與設備 超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養箱、高速冷凍離心機、精密pH計、精密電子天平、透析袋、722型可見分光光度計。

1.4 EPS的提取工藝 取菌種5 mL接于100 mL MRS培養基中，37℃恒溫培養24 h，將培養液在6000 r/min、10℃條件下離心15 min去除菌體。向收集的培養上清液中加入三氯乙酸至終濃度為8%，充分攪拌后于4℃靜置過夜，離心(10000 r/min，4℃，20 min)去除蛋白質，收集上清液。向上清液中加入3倍體積90%的乙醇，于4℃靜置過夜。小心吸出上清液，向其中加入無水乙醇進行洗滌，直至溶液為無色為止。用蒸餾水溶解洗滌所得的沉淀，并移至透析袋中透析2 d，每天換水3次。用PEG 20000濃縮透析袋中的溶液至25 mL以下，用苯酚-硫酸法[9]測定多糖含量。

1.5 Plackett-Burman試驗設計 本研究選取培養溫度、培養時間、pH值、酵母粉、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨和接種量7個因素，應用軟件Design-Expert 8.0進行Plackett-Burman設計，從而篩選出影響EPS產量的3個主要因素。

1.6 最陡爬坡試驗設計 根據Plackett-Burman法篩選出的顯著因子效應大小設計它們的步長，進行最陡爬坡試驗設計，尋找最大產區。

1.7 Box-Behnken優化試驗設計 根據Plackett-Burman試驗結果，應用軟件Design-Expert 8.0對篩選的三個主要因素進行Box-Behnken優化設計，同時固定其他非關鍵因素。

2 結果

2.1 Plackett-Burman試驗設計結果 Plackett-Burman設計因子水平表及結果分別見表1和表2。采用Design-Expert軟件對表2中的EPS產量數據進行回歸分析，得到各影響因子的偏回歸系數及其重要性(表3)。由表3可知，酵母粉對鼠李糖乳桿菌產EPS影響最大，重要性為6.73。其次為培養溫度，重要性為1.92。接種量、檸檬酸氫二銨、pH值、磷酸氫二鉀和培養時間對EPS產量的影響依次降低，重要性分別為 1.18、1.08、0.79、0.72 和0.32。酵母粉、接種量、磷酸氫二鉀和培養時間對EPS產量的影響為正相關;培養溫度、檸檬酸氫二銨、pH對EPS產量的影響為負相關。故選取三個最重要的因素(酵母粉、培養溫度和接種量)做進一步優化試驗。

表1 Plackett-Burman設計因子水平

表2 Plackett-Burman試驗設計結果

表3 偏回歸系數及影響因子的顯著性分析

2.2 最陡爬坡試驗結果 響應面擬合方程只有在考察的臨近區域里才能充分近似真實情況，故應先逼近最大產區后再建立有效的擬合方程。根據Plackett-Burman試驗篩選出的3個影響EPS產量的重要因素，運用最陡爬坡試驗找出EPS產量最大的區域。最陡爬坡試驗結果見表4。由表4可知，當培養溫度為30℃、酵母粉為30 g/L、接種量為6%時，EPS產量最大，當條件處于其兩邊或更遠時產量逐漸下降。由此可以確定EPS產量最大值的條件應當在培養溫度為30℃、酵母粉為30 g/L、接種量為6%附近區域。

2.3 Box-Behnken優化設計結果 根據最陡爬坡試驗結果，將培養溫度為30℃、酵母粉為30 g/L、接種量為6%作為中心條件采用Box-Behnken法進一步優化，各因素水平見表5，優化設計結果見表6。采用Design-Expert軟件對表6中的EPS產量數據進行分析，得到模擬曲線，對應的模擬方程為:Y=354．05-4．65X1+9．27X5-4．53X6+18．88X1X5+13．87X1X6-9．49X5X6-22．80X21-47．00X25-28．66X26。此模擬方程的擬合度為93.43%，說明試驗數據能較好的預測EPS的實際產量。對模擬方程進行方差分析，結果見表7。由表7可知，模擬方程的P＜0.05，說明模擬方程對EPS產量的影響是顯著的。模擬方程的一次項和交叉項對EPS產量的影響均不顯著，而二次項顯著，其中酵母粉的二次項為極顯著，其余為顯著。這說明各因素與EPS產量的關系并不是簡單的線性關系，而是一個復雜的二次關系。

表4 最陡爬坡試驗結果

表5 Box-Behnken設計各因素水平

表6 Box-Behnken設計及結果

表7 方程中各參數的回歸系數

2.4 響應面分析 根據模擬方程，運用Design-Expert軟件繪制各因素交互作用對EPS產量影響的響應面曲線圖(圖1)。由圖1A可知，接種量固定為6%時，當溫度不變，EPS產量隨酵母粉的增加先增后減;當酵母粉不變時，EPS產量隨溫度的升高而減少，這與Plackett-Burman試驗中溫度呈負相關的結論相一致。由圖1B可知，溫度固定為30℃，當酵母粉不變時，EPS隨接種量的增加先增后減，當接種量不變時，EPS產量隨酵母粉的增加先增后減;由圖1C可知，酵母粉固定為30 g/L時，當溫度不變，EPS產量隨接種量的增加而減少;當接種量不變，EPS產量隨溫度的增加而減少。響應面曲線存在著EPS產量最大值，運用軟件預測出產EPS產量最大的條件是:溫度29.7℃、酵母粉30.45 g/L、接種量5.76%，EPS產量可達到354.97 mg/L。

圖1 各因素交互作用對EPS產量影響的響應面曲線圖

2.5 回歸模型的驗證 為了驗證響應面法是否具有實用性和可靠性，根據篩選出的最佳發酵條件為實驗條件，進行了兩次平行實驗，EPS產量分別為349.59 mg/L和352.26 mg/L。實驗值和理論值基本一致，說明響應面法具有較好的實用性和可靠性。

3 討論

乳酸菌胞外多糖(EPS)是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到細胞壁外常滲于培養基的一類糖類化合物，根據結構可分為同多糖和雜多糖[1]。乳酸菌EPS的形成除了有利于改善產品的黏度和質地外，還具有降血脂、免疫調節和抗腫瘤等功能[5-6]。因此乳酸菌EPS作為微生物多糖的一個重要來源成為近年來的研究熱點。

乳酸菌同多糖的生物合成是在細胞外進行的。特異性的糖基轉移酶參與合成反應，并由蔗糖提供能量。乳酸菌雜多糖的生物合成是在細胞質中進行的，其過程比較復雜，涉及多種酶的參與。葡萄糖是雜多糖生物合成所需的糖源，在細胞內可轉化為葡萄糖-6-磷酸，這是合成EPS的關鍵中間產物，再經磷酸葡萄糖變位酶形成葡萄糖-1-磷酸，后經dTDP葡萄糖焦磷酸化酶生成EPS前體——糖核苷酸。糖核苷酸最終聚合成具有重復單元的EPS，并通過細胞膜轉移分泌到細胞外[10]。目前重復單元的聚合機制以及聚合體的分泌輸出機制仍不清楚。

乳酸菌EPS的產量與菌種有密切關系[2]。菌株不同，EPS的合成能力差別很大，而同一菌株發酵條件不同，EPS的產量也有明顯差異。此外，培養基的成分(碳源、氮源、無機鹽等)和生長條件(溫度、pH、接菌量、培養時間等)也是影響EPS產量的重要因素[11]，且不同營養條件和環境條件下產生的EPS的化學結構和生理功能也有差異[12]。

培養基中氮源對乳桿菌胞外多糖產量有較大影響。半合成培養基中添加蛋白胨、酵母氮源和酵母提取物能提高乳桿菌EPS的產量[13]。礦物質也是影響乳桿菌EPS的重要因素[14]，本研究選用應用廣泛的磷酸氫二鉀進行研究，結果影響不顯著，說明礦物質與菌株之間具有特異性關系，有效的礦物質還需要進一步篩選。發酵時間也是影響EPS產量的重要因素之一[9-10]，一般認為穩定期相比對數生長期能生產更多的EPS，但隨著培養時間進一步延長，總產量會降低，這可能與培養基中營養成分的減少有關，因此本研究選取26～48 h進行研究。溫度對乳酸菌EPS合成的影響因菌株、培養條件不同而有差異[9-10]。一些菌株在相對較低的溫度下有利于EPS的合成，這可能是由于在較低溫度下，細胞壁的合成較慢，從而使較多的磷酸類異戊二烯用于EPS的合成。本研究的最適發酵溫度為29.7℃，低于菌體最適生長溫度37℃，與前人結果一致。不同菌株和培養條件下的EPS合成的最適pH不同。研究證明，乳酸菌產EPS的最適pH值在6～7左右，因此本研究選擇pH 5.9～7.1范圍進行研究。接種量是影響EPS產量的另一個重要因素，本研究選取三個梯度，結果表明接種量在6%時產量最高。

雖然乳酸菌EPS產量依賴于菌種本身特性，但通過優化產EPS的最適培養條件，可以在一定程度上提高產量。由于影響EPS產量的因素較多，各種因素并不是孤立地起作用，而是相互影響和相互依賴的關系，給條件優化帶來一定困難。雖然正交實驗設計也可找出最優條件組合，但它難以直觀地判別優化區域。響應面分析方法也是一種最優化方法[8]，是研究多種因素間交互作用的回歸分析方法，此方法能給出直觀的圖形，因而也能憑直覺觀察其最優化點，它是將體系的響應(EPS產量)作為多個因素(發酵溫度、氮源、接種量等)的函數，運用圖形技術將這種函數關系顯示出來，可以直觀地分析各因素對響應值(EPS產量)的影響，以及各因素之間的交互作用。要構造這樣的響應面，必須通過大量的試驗數據(表6)建立一個合適的數學模型，再用此數學模型作圖(圖1)。

本研究首先采用Plackett-Burman法篩選出影響EPS產量的3個重要因素，再用最陡爬坡試驗找出EPS產量最大的區域，最后用Box-Behnken法做出響應面曲線圖。結果表明，鼠李糖乳桿菌產EPS最佳條件為溫度29.7℃、酵母粉30.45 g/L、接種量5.76%，此時EPS產量最大，為354.97 mg/L。

[1]Kleerebezem M，Hols P，Bernard E，et al.The extracellular biology of the lactobacilli[J].FEMS Microbiol Rev，2010，34(2):199-230.

[2]Welman A D，Maddox I S.Exopolysaccharides from lactic acid bacteria:perspectives and challenges[J].Trends Biotechnol，2003，21(6):269-274.

[3]Sutherland I.A sticky business.Microbial polysaccharides:current products and future trends[J].Microbiol Today，2002，29:70-71.

[4]Ruas-Madiedo P，Gueimonde M，Margolles A，et al.Exopolysaccharides produced by probiotic strains modify the adhesion of probiotics and enteropathogens to human intestinal mucus[J].Journal of Food Protection，2006，69(8):2011-2015.

[5]Liu C F，Tseng K C，Chiang S S，et al.Immunomodulatory and antioxidant potential of Lactobacillus exopolysaccharides[J].J Sci Food Agr，2011，91(12):2284-2291.

[6]Abd El-Gawad I，El-Sayed E，Hafez S，et al.Inhibitory effect of yoghurt and soya yoghurt containing bifidobacteria on the proliferation of Ehrlich ascites tumour cells in vitro and in vivo in a mouse tumour model[J].Brit J Nutr，2004，92(1):81-86.

[7]Gamar-Nourani L，Blondeau K，Simonet J M.Influence of culture conditions on exopolysaccharide production by Lactobacillus rhamnosus strain C83[J].J Appl Microbiol，1998，85(4):664-672.

[8]Bas D，Boyac i H.Modeling and optimization I:Usability of response surface methodology[J].J Food Eng，2007，78(3):836-845.

[9]馮美琴，邢家溧，張 琦，等.植物乳桿菌胞外多糖發酵條件的優化[J].食品科學，2011，(23):215-219.

[10]李盛鈺，曾憲鵬，楊貞耐.提高乳酸菌胞外多糖產量的途徑[J].食品與生物技術學報，2009，(3):289-293.

[11]Ai L，Zhang H，Guo B，et al.Preparation，partial characterization and bioactivity of exopolysaccharides from Lactobacillus casei LC2W[J].Carbohyd Polym，2008，74(3):353-357.

[12]Ruas-Madiedo P，Hugenholtz J，Zoon P.An overview of the functionality of exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria[J].Intern Dairy J，2002，12(2/3):163-167.

[13]De Vuyst L，Degeest B.Heteropolysaccharides from lactic acid bacteria[J].FEMS Microbiol Rev，1999，23(2):153-177.

[14]Cerning J，Bouillane C，Landon M，et al.Isolation and characterization of exopolysaccharides from slime-forming mesophilic lactic acid bacteria[J].J Dairy Sci，1992，75(3):692-699.