馬玲薯葡萄糖培養基在延胡索酸泰妙菌素菌種選育中的應用

馬繼花，張 萍，石彥鵬，張亞強

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司菌種研究所，銀川 750101)

延胡索酸泰妙菌素(Tiamulin Fumarate)是由高等真菌擔子菌側耳屬(Pleuroutus mutilus)通過發酵得到截短側耳素后，再經過化學合成得到的氫化延胡索酸鹽，是一種雙萜烯類獸用抗生素。本品抗菌譜與大環內酯類抗生素相似，主要抗革蘭氏陽性菌，對金黃色葡萄球菌、鏈球菌、支原體、豬胸膜肺炎放線桿菌、豬密螺旋體痢疾等有較強的抑制作用，對支原體的作用強于大環內酯類;對革蘭氏陰性菌尤其是腸道菌作用較弱。其主要用于防治雞的慢性呼吸道病、豬支原體肺炎、放線菌性胸膜肺炎和密螺旋體性痢疾等，低劑量可以促進生長，提高飼料利用率。最新研究表明，泰妙菌素與抗腫瘤藥物聯用可增強腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性，顯示了其在腫瘤治療方面的潛在價值[1]。目前泰妙菌素菌種的生產能力較低，發酵產量低，不能滿足發酵行業生產的需要，因此，提高泰妙菌素的產量是生產企業亟待解決的問題，而選育泰妙菌素高產菌株是行之有效的方法。馬鈴薯葡萄糖培養基是實驗室里使用最普遍的真菌培養基，它也被廣泛應用于食用菌母菌的培養中[2]。同樣作為真菌的擔子菌側耳屬的泰妙菌素產生菌，能否在該培養基上生長并體現出它獨有的優勢，本文以生產用的麥芽浸膏培養基為對照，通過對菌種的分離、篩選以及采用HPLC法測定泰妙菌素的含量，最終獲得了4株高于對照的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 菌株TMⅡ10-444由寧夏泰瑞制藥股份有限公司菌種研究所分離純化獲得。

1.1.2 培養基 平板培養基;麥芽浸膏培養基:葡萄糖、麥芽浸膏、酵母膏、瓊脂粉;馬鈴薯葡萄糖培養基:馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂粉;種瓶培養基:葡萄糖、硝酸鈣、消泡劑;發酵培養基:葡萄糖、玉米漿、豆油。均參照寧夏泰瑞制藥股份有限公司企業內控標準。

1.1.3 試劑 酵母膏和麥芽浸膏，北京奧博星生物技術有限公司;瓊脂粉，青島凍粉廠;玉米漿，華北制藥康欣有限公司;硝酸鈣、硫酸鎂、葡萄糖等均為分析純試劑。

1.1.4 儀器與設備 Waters2695/2487型高效液相色譜儀，美國Waters公司;C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);XDW25/96 型旋轉搖瓶機，樂山長征制藥機械有限公司;凈化工作臺，無錫市榮豐凈化空調設備廠;恒溫恒濕培養箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.2 方法

1.2.1 使用菌株的選擇 選擇TMⅡ10-444作為出發菌株，用麥芽浸膏培養基進行分離純化，搖瓶效價為14046 U/mL。

1.2.2 平板培養基的制備 麥芽浸膏培養基:用電子天平(精度0.001 g)準確稱取培養基所需量的葡萄糖、麥芽浸膏和酵母膏，加純化水攪拌使其充分溶解，再加入瓊脂粉，并加熱溶解至透亮，將溶液倒入量筒中補充純化水至所需體積，攪拌均勻后分裝于750 mL三角瓶中，于120～121℃、0.10～0.11 MPa高壓蒸汽滅菌30 min，在凈化工作臺上制備成平板，待用。

馬鈴薯葡萄糖培養基:取新鮮馬鈴薯洗凈去皮，切塊后加純化水適量煮沸30 min，然后用4層紗布過濾取汁，稱取葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、維生素B1微量，逐個用純化水溶解，再加入瓊脂粉，加熱溶解并補足體積至1 L，攪拌均勻后分裝于750 mL三角瓶中，于120～121℃、0.10～0.11 MPa高壓蒸汽滅菌30 min，在凈化工作臺上制備成平板，待用。

1.2.3 稀釋平板分離 鏟取斜面菌絲，置于加有生理鹽水的研磨器中，研磨至混濁、無片狀菌絲，吸取菌懸液1 mL，按照10倍稀釋法用生理鹽水稀釋成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，依次涂布于制備的兩種不同平板培養基上，工藝條件下置恒溫恒濕培養箱中培養3～5 d，觀察平板生長情況。

1.2.4 單菌落篩選

1.2.4.1 挑選單菌落 分別挑取兩種平板上生長成熟的單菌落接種于麥芽浸膏斜面培養基上，制備成斜面，其中馬鈴薯葡萄糖平板上挑取單菌落86支，麥芽浸膏平板上挑取單菌落77支，斜面上標注單菌落編號后置于同一培養箱中培養，每日定時觀察單菌落的生長情況，并記錄生長過程。

1.2.4.2 初篩 以出發菌株在麥芽浸膏培養基上制備的斜面作為對照，將培養好的單菌落斜面對號接入發酵瓶，一支斜面接一個發酵瓶，同時放置同一搖瓶機上，于工藝條件下搖瓶培養，培養結束后取發酵液用甲醇1∶9稀釋提取后，測定其HPLC效價。

1.2.4.3 復篩 根據初篩結果從馬鈴薯葡萄糖培養基中選出8支菌株進行復篩，從麥芽浸膏培養基中挑選出4支菌株進行復篩(以出發菌株在麥芽浸膏培養基上制備的斜面作為對照)，復篩采用二級發酵，一支斜面接一個種子瓶，培養成熟后接入發酵瓶培養基，每個種子瓶平行接三個發酵瓶，連續復篩2批，搖瓶培養，培養結束后取發酵液用甲醇1∶9稀釋提取后，測定其HPLC效價。

1.2.5 傳代穩定性驗證 將保藏的4株單菌落斜面進行傳代培養，連續傳三代，待斜面培養成熟后進行搖瓶驗證。同復篩驗證方法，連續驗證2批。對照組同1.2.4.3項。比較并分析其相對標準偏差(RSD)值，判斷其穩定性。

2 結果與分析

2.1 菌落形態及個體形態的觀察 從不同平板培養基上選擇不同類型菌落進行記錄，馬鈴薯葡萄糖培養基平板上長出的菌落表面干燥，外觀形態大而疏松，菌絲相互交織，粗而分化，菌落不透明，菌落與培養基之間粘合牢固，較難研磨，培養11～12 d可以挑取單菌落，培養11 d時單菌落外觀形態見圖1。對照組麥芽浸膏培養基平板上長出的菌落表面干燥，但菌落的外觀形態較小而致密，菌絲相互交織，粗而分化，菌落不透明，菌落與培養基之間粘合牢固，比較好研磨，培養13～14 d可以挑取單菌落，培養11 d時單菌落外觀形態見圖2。

圖2 麥芽浸膏培養基平板11 d菌落形態

圖1 馬鈴薯葡萄糖培養基平板11 d菌落形態

2.2 初篩驗證結果 從馬鈴薯葡萄糖培養基平板上挑取86株單菌落，擴培到麥芽浸膏培養基上制成斜面，經搖瓶初篩驗證有11株效價高于對照，高效價菌株占總挑選數的12.8%;同時從麥芽浸膏培養基上挑取77株單菌落，擴培到麥芽浸膏培養基上制成斜面，經搖瓶初篩驗證有5支效價高于對照，高效價菌株占總挑選數的6.5%。根據初篩驗證效價，挑選出馬鈴薯葡萄糖培養基選育的8支效價較高的菌株 2107、2115、2154、2165、2183、2189、2201、2216和麥芽浸膏培養基選育的4支效價較高的菌株 2253、2262、2283、2289 進行復篩驗證。

2.3 復篩驗證結果 如表1所示，從復篩效價分析，馬鈴薯葡萄糖培養基上選育的8支菌株，其復篩驗證效價均高于麥芽浸膏培養基上選育的4支菌株，且高于對照組，經過兩次復篩搖瓶驗證，將2107、2115、2165、2183 共 4 支單菌落斜面用液體石蠟覆蓋保藏。

表1 復篩驗證結果 U/mL

2.4 篩選菌株穩定性驗證結果 從表2中的數據可以得出，2107、2115、2165和2183共4支菌株的第三代傳代斜面其驗證效價均高于出發株斜面(對照)，而且RSD值較小，說明這4支菌株傳代穩定性較好。

表2 穩定性驗證結果

3 討論

3.1 自然選育作為菌種選育中的一種重要手段，具有顯著的優勢，其操作簡單，可通過肉眼觀測以及測定發酵產物成分即可選育出效價高的菌株，在工業生產中應用廣泛。馬鈴薯葡萄糖培養基作為常見的真菌培養基，搖瓶驗證表明馬鈴薯葡萄糖培養基適用于延胡索酸泰妙菌素產生菌的生長。通過涂布法將TMⅡ10-444菌株分離在馬鈴薯葡萄糖培養基和麥芽浸膏培養基上，置于同一生長條件下培養，每天定時觀察其生長情況并記錄菌株生長過程，馬鈴薯葡萄糖培養基可以使菌種的生長周期從麥芽浸膏培養基上的14 d縮短到11 d，有效地縮短了選育周期，提高了選育的效率。

3.2 對于生產的菌種而言，其穩定性必須得到保證，馬鈴薯葡萄糖培養基所選育的菌種傳代培養結果顯示穩定性表現良好，并且比正常生產的搖瓶效價高，初步表明其可用于生產。

3.3 由于麥芽浸膏在培養基中的用量大、價格昂貴，極大地增加了生產成本;而馬鈴薯葡萄糖培養基使用的原料主要為馬鈴薯、葡萄糖等，成本較低，而且選育周期比麥芽浸膏培養基縮短3～4 d，綜合比較，馬鈴薯葡萄糖培養基具有一定的優勢，其可以成為延胡索酸泰妙菌素產生菌菌種選育的一種新方法。

[1]鄒 懿，黃宇琪，胡昌華.截短側耳素及其衍生物的研究進展[J].中國抗生素雜志，2009，34(2):65-68.

[2]董洪梅，王新風.PDA培養基的微波滅菌研究[J].北方園藝，2005，(1):71-72.