支原體檢驗用培養基質控菌株的生長曲線與世代時間測定

劉軼秋，丁家波，李蓓蓓，徐 磊，張瑞婷

(1.中國獸醫藥品監察所，北京 100081;2.中國農業科學院上海獸醫研究所，上海 200241)

《中國獸藥典》二〇一〇年版三部規定支原體培養基制成后需進行質控檢驗，合格后方可用于生物制品的支原體檢驗[1]。用于質控檢驗的質控菌株分別為滑液支原體(CVCC2960)和豬鼻支原體(CVCC361)。滑液支原體用于改良Frey氏液體培養基、改良Frey氏固體培養基的質控檢驗;豬鼻支原體用于支原體液體培養基、支原體固體培養基、無血清支原體培養基的質控檢驗。為了解兩種質控菌株的生長繁殖特性，本試驗通過測定兩種菌株在不同培養時段的CCU(color change unit，CCU)，繪制生長曲線并確定世代時間，為支原體檢驗用培養基的質控檢驗提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 滑液支原體(CVCC2960)、豬鼻支原體(CVCC361)，均由中國獸醫藥品監察所提供。

1.1.2 培養基

1.1.2.1 改良Frey氏液體培養基 配方為:氯化鈉(5.0 g/L)，氯化鉀(0.4 g/L)，硫酸鎂(含7個結晶水)(0.2 g/L)，磷酸氫二鈉(含12個結晶水)(1.6 g/L)，磷酸二氫鉀(0.2 g/L)，葡萄糖(10.0 g/L)，乳蛋白水解物(5.0 g/L)，酵母粉(5.0 g/L)，1%輔酶I溶液(10.0 mL/L)，1%L-半胱氨酸溶液(10.0 mL/L)，2%精氨酸溶液(20.0 mL/L)，馬血清(100.0 mL/L)，1%酚紅溶液(1.0 mL/L)，青霉素(800 IU/mL)，1%醋酸鉈溶液(10.0 mL/L)，用1 mol/L NaOH調pH值至7.6～7.8，濾過除菌，置4℃保存備用。

1.1.2.2 支原體液體培養基 配方為:PPLO肉湯粉(21.0 g/L)，葡萄糖(5.0 g/L)，10%精氨酸溶液(10.0 mL/L)，10 倍 MEM 培養液(10.0 mL/L)，酵母粉(5.0 g/L)，青霉素(800 IU/mL)，1%醋酸鉈溶液(10.0 mL/L)，馬血清(100.0 mL/L)，1%酚紅溶液(1.0 mL/L)，用1 mol/L NaOH調pH值至7.6～7.8，濾過除菌，置4℃保存備用。

1.1.3 儀器 生物安全柜;37℃恒溫培養箱;電子天平;pH計;濾器;冰柜。

1.2 方法

1.2.1 菌液培養

1.2.1.1 滑液支原體 將-20℃凍存的滑液支原體菌株恢復原體積后，按5%比例接種到10 mL改良Frey氏液體培養基中培養，取培養后的菌液，按照5%比例傳3代，取生長穩定的菌液作為待測菌液，按5%比例接種培養基，置37℃培養箱中培養，從0 h開始，每隔6 h進行一次活菌計數。

1.2.1.2 豬鼻支原體 將-20℃凍存的豬鼻支原體菌株恢復原體積后，按5%比例接種到10 mL支原體液體培養基中培養，取培養后的菌液，按照3%比例傳3代，取生長穩定的菌液作為待測菌液，按3%比例接種培養基，置37℃培養箱中培養，從0 h開始，每隔6 h進行一次活菌計數。

1.2.2 生長曲線繪制 從0 h開始，每隔6 h從待測菌液中取樣，采用10倍系列稀釋計數法進行計數。具體方法是:將培養基分裝成每管1.8 mL，第1管加入待測菌液0.2 mL，混勻后，取0.2 mL加入第2管中，再混勻，取0.2 mL加入到第3管中，依此操作一直至第10管，將第10管中混勻后取0.2 mL棄去。每個時間點取樣3份，將試管置于37℃培養箱中培養，試驗設未接種菌液的培養基作為陰性對照。每天觀察試管培養基顏色變化，直至培養基顏色不再變化時，結束觀察。判定滴度:以培養基顏色變化的最高稀釋度作為待測菌液的生長滴度，即CCU表示[2]。用3份樣品的平均 CCU，n=3)表示該時間點支原體CCU。以取樣時間點為橫坐標，平均 CCU的對數為縱坐標，繪制生長曲線。

1.2.3 世代時間的計算 世代時間(generation time)[3]，即菌體每繁殖一代所需的時間，用 G表示。分別取滑液支原體、豬鼻支原體生長曲線對數生長期中的一段，按如下公式計算世代時間:

式中，G為世代時間，t為培養時間，Mo為開始時的活菌數，Mt為經t時間培養后的活菌數。

2 結果

2.1 質控菌株在培養基中不同生長時段的CCU結果如表1、表2所示。從表1可以看出，滑液支原體在改良Frey氏液體培養基中最高可生長至7.0×108CCU/mL，54 h后活菌數開始下降，直至96 h滴度為0。從表2看出，豬鼻支原體在支原體液體培養基中最高可生長至1.0×109CCU/mL，且在126 h之后活菌數開始下降，直至216 h滴度為0。

表1 滑液支原體不同生長時段的CCU及對數值

表2 豬鼻支原體不同生長時段的CCU及對數值

續表

2.2 質控菌株的生長曲線圖 從圖1可知，滑液支原體菌株在接種后6 h內為遲緩期，6～36 h為對數期，36～54 h為穩定期，54 h之后為衰老期。從圖2可知，豬鼻支原體菌株在接種后6 h內是遲緩期，6～18 h為對數期，18～126 h為穩定期，126 h之后為衰老期。

2.3 質控菌株的世代時間 滑液支原體對數期在6～36 h，t1=12 h，t2=30 h，代入公式，滑液支原體世代時間G=231.8 min;豬鼻支原體對數期在6～18 h，t1=6 h，t2=18 h，代入公式，豬鼻支原體世代時間G=117.1 min。

3 討論

3.1 《中國獸藥典》[1]規定滑液支原體和豬鼻支原體作為支原體培養基檢驗用質控菌株，傳代培養均不得超過5代。支原體質控菌株開啟后，在適宜液體培養基上培養，為使支原體在培養基中生長穩定，連續培養直至第3代，用第3代菌液培養物作為培養基質控菌株的種子液，在用于質控檢驗時，將種子液繼續傳代，用第4代或第5代菌液培養物作為質控菌株對培養基進行檢驗。為了保證質控菌株在培養過程中生長速度穩定、均一，菌液繁殖到第5代終止，不再繼續傳代。

3.2 支原體是一類缺乏細胞壁的原核微生物，它在液體培養基的生長曲線與細菌相同，可分為遲緩期、對數生長期、穩定期、衰老期[4]。為保證質控菌株生長穩定，菌株培養后每次傳代，均按照豬鼻支原體3%、滑液支原體5%的比例接種培養基，且每次傳代培養均在108CCU/mL數量級收獲菌液。從兩個質控菌株生長曲線圖分析，滑液支原體菌株最佳收獲時間在培養后36～54 h，豬鼻支原體菌株最佳收獲時間在培養后18～126 h，在此時段內收獲的菌液，其CCU均維持在108～109CCU/mL數量級。但在研究中發現，培養時間相差6～12 h的支原體菌液顏色幾乎沒有差別，而CCU卻相差1～2個數量級，這就提示在培養菌液過程中，把握好收獲時間至關重要。如果質控菌株不在穩定期中收獲，可能導致菌液滴度不夠高，即使使用的是合格的培養基，滴度也達不到合格的標準。所以，本研究提示在穩定期及時收獲菌液、及時保存，才能保證支原體檢驗培養基質控菌株滴度的穩定和均一，保證支原體培養基檢驗結果的準確。

3.3 培養基質量直接影響生物制品檢驗結果的準確性，所以質控菌株作為一個衡量培養基合格與否的標尺，更是起到了至關重要的作用。目前，現行《中國獸藥典》在質控菌株標準化方面還沒有十分具體的規定。雖然試驗初次通過繪制生長曲線和確定世代時間來探索質控菌株的生長規律，為培養基檢驗及質控菌株的使用提供了一定的數據參考，但是質控菌株的標準化工作還需大量試驗進行驗證，例如質控菌株的傳代次數、菌液接種培養基的適宜比例、生長滴度變化等方面還需進一步確證并作詳細規定。另外，在質控菌株培養方面，傳統上一直采用肉眼觀察的方式對培養液顏色進行判斷，試驗中發現此方法準確性不高，且不同試驗人員判斷亦存在差異，建議采用酸度計測定取代肉眼觀察方法，使試驗結果更可信。

[1]中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二○一○年版三部[S].

[2]Loens K，Mackay W G，Scott C，et al.A multicenter pilot external quality assessment programme to assess the quality of molecular detection of Chlamydophila pneumoniae and Mycoplasma pneumoniae[J].J Microbiol Meth，2010，82(2):131-135.

[3]武漢大學，復旦大學生物系微生物學教研室.微生物學[M].3版.北京:高等教育出版社，1989.

[4]吳移謀，葉元康.支原體學[M].北京:人民衛生出版社，2008:38.