新城疫濃縮滅活疫苗的初步研究

李俊平，李啟紅，楊承槐，劉 丹，李慧姣，蔣桃珍，黃建華

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒引起的一種侵害禽類的急性高度接觸性傳染病，是造成我國養雞業重大經濟損失的主要病原之一。疫苗免疫是預防該病的有效手段，目前在我國注冊用于生產ND活疫苗的毒株有低毒力毒株HB1株、La Sota株、Clone30株、VG/GA株、V4/HB92克隆株，滅活疫苗毒株主要是La Sota株。符合質量標準的ND疫苗免疫雞后，可以有效保護ND強毒株的攻擊。近年來，雖然可見有關NDV基因型的變化及不同基因型致病性差異的報道[1-5]，但尚無可靠的試驗數據證明現有疫苗免疫無法保護某一基因型NDV的攻擊。

常規雞ND滅活疫苗在生長周期較短的肉用雞中被廣泛使用，這對控制肉雞ND疫病發揮了重要作用。但由于常規疫苗使用劑量大，注射部位易出現較重的局部炎癥反應或肉雞屠宰時仍有疫苗未能完全吸收，這不僅影響雞肉的品質，同時因為疫苗用佐劑為體內不可代謝的礦物油，也存在著一定的食品安全隱患。為解決這一問題，本研究對現有滅活疫苗制造規程進行量化并研究了不同濃縮倍數疫苗的免疫效力，初步優化了新城疫濃縮滅活疫苗的最佳生產工藝。該生產工藝不僅大大減少了疫苗的使用劑量，同時疫苗的免疫效力也相應提高，有望為肉雞新城疫的有效控制和食品安全提供保障。

1 材料和方法

1.1 病毒株 雞新城疫病毒(La Sota株)，病毒含量為108.5EID50/0.1mL。

1.2 SPF雞胚及SPF雞 由北京實驗動物中心提供，SPF種蛋孵至9～11日齡備用。

1.3 ND抗原增殖條件的優化 選用10日齡非免疫雞胚，設定3個滴度(103.0、104.0和105.0EID50/0.1 mL)的NDV病毒含量用于接種，每個劑量接種非免疫雞胚130～140枚，每胚0.1 mL，接種后不同時間分別收獲死亡和存活的雞胚。測定收獲抗原的EID50、HA和總蛋白。同時設不接毒組作為對照，收獲尿囊液作HA和總蛋白含量測定。

1.4 抗原濃縮 根據1.3項試驗結果確定的ND抗原增殖條件，制備ND抗原。抗原經離心去沉淀后，采用Millipore公司生產的截留分子量為100 kD的濃縮濾膜對ND抗原進行濃縮，分別濃縮至總體積的 1/2、1/3、1/4、1/10，測定濃縮液和濾過液中抗原的EID50、HA和總蛋白。

1.5 不同濃縮倍數疫苗的免疫效力研究 用10倍濃縮的抗原加PBS配制成了原倍抗原、3倍抗原、5倍抗原和10倍抗原，分別以水相∶油相=1∶2乳化制備4批疫苗。每批疫苗經胸部肌肉注射接種4周齡的SPF 雞10 只，14、21、28、35 d 采血測定HI效價。

2 試驗結果

2.1 ND抗原的增殖條件 分別以103.0EID50、104.0EID50和105.0EID50病毒含量接種10日齡非免疫雞胚，結果表明，隨著培養時間的增加，雞胚死亡增多，且死亡數量隨接種劑量的增大而增多(表1)。測定收獲抗原的EID50、HA和總蛋白，結果見表2。結果表明103.0EID50和104.0EID50接種組收獲的病毒含量和HA效價較105.0EID50接種組高;抗原中總蛋白含量隨培養時間的增加而增高，但總蛋白含量與病毒含量及HA效價無明顯的相關性，同期收獲尿囊液中接毒組總蛋白含量低于對照組，可見通過測定總蛋白含量無法可靠衡量抗原含量。

由試驗結果可確定ND抗原的增殖條件如下:選用10日齡發育良好的非免疫雞胚，每胚經尿囊腔接種0.1 mL(含103.0～104.0EID50)的病毒液。棄60 h內死亡雞胚，此后，每4～6 h照蛋1次，隨時取出死亡雞胚，直至96 h，不論死亡與否，全部取出，置于2～8℃冷卻4～24 h，無菌收獲尿囊液。

表1 不同接種劑量雞胚死亡情況

表2 不同接種劑量和收獲時間對收獲抗原的影響

續表

2.2 抗原濃縮 根據ND抗原增殖條件的優化試驗結果，制備了約10000 mL的ND抗原，病毒含量為108.5EID50/0.1mL，HA效價為210。將制備的ND 抗原分別濃縮至總體積 1/2、1/3、1/4、1/10，測定濃縮液和濾過液中抗原的EID50、HA和總蛋白，結果見表3。結果表明，100 kD濾膜能有效截留NDV，濃縮倍數與HA效價及病毒含量成正相關;濾過液中含有部分具有感染性的病毒，但測不到血凝價。收獲的尿囊液中總蛋白濃度與濃縮倍數相關性不強。因此可采用HA效價作為濃縮抗原的質量評價標準。

表3 ND濃縮抗原的HA效價和病毒滴度

2.3 不同濃縮倍數疫苗的免疫效力 原倍抗原、3倍抗原、5倍抗原和10倍抗原，以水相∶油相=1∶2乳化制備4批疫苗，分別為 ND01、ND03、ND05和ND10。免疫試驗結果表明，免疫雞的HI抗體效價基本與抗原濃縮倍數成正相關，但當HA效價達到一定水平后，免疫雞的HI抗體滴度即保持一定水平而無明顯升高。采用3倍濃縮抗原制備的疫苗，以5 μL的劑量(標準檢驗劑量的1/4)免疫SPF雞，即可達到合格的抗體效價，并且免疫后35 d效價依然在較高水平，詳細結果見表4。

3 討論與小結

3.1 ND抗原繁殖時接毒劑量的優化 《中華人民共和國獸用生物制品規程》(二〇〇〇年版)(簡稱規程)[6]中雞新城疫滅活疫苗制造與檢驗規程中有關ND抗原制備的接種方法為:取生產用種毒，用滅菌生理鹽水作適當稀釋(如10-4或10-5)，每胚尿囊內接種0.1 mL。規程中對接毒的病毒含量未做具體要求，對生產者指導性不強。本研究結果表明每胚經尿囊腔接種 0.1 mL(含 103.0～104.0EID50)的病毒液收獲的尿囊液病毒含量高，從而對現有規程中雞新城疫滅活疫苗制造及檢驗規程的接毒劑量進行了量化，對ND抗原的生產更具有指導意義。

表4 不同濃縮倍數疫苗免疫后的HI抗體效價

3.2 ND病毒的濃縮工藝 病毒濃縮是增加疫苗抗原濃度，降低副反應，提高免疫效果的有效手段，已在我國獸用疫苗生產中廣泛應用，尤其是生產多聯滅活疫苗時，需對各抗原成分進行適當濃縮[7]。有關禽用疫苗病毒濃縮技術研究，新城疫病毒濃縮工藝研究已有報道[8-9]，但采用的濃縮系統不同，實驗結果有所差別。本研究在參考文獻報道的基礎上，小試時選用了3種不同孔徑的濾膜，結果100 kD濾膜能有效截留NDV，50 kD濾膜可有效截留NDV，但濾過效率低，而300 kD濾膜無法有效截留NDV，所以選用100 kD濾膜濃縮ND抗原。在對濃縮效果評價指標方面，病毒含量(EID50)及蛋白含量雖然隨濃縮倍數的提高而增加，但缺乏良好的線性關系，而且測定周期相對較長，無法及時準確評價濃縮效果;HA效價與濃縮倍數具有良好的正比線性關系，測定簡單，用時少，能夠及時準確評價濃縮效果，是確定濃縮效果的可靠指標。

3.3 ND病毒抗原濃縮倍數與免疫效果 3倍濃縮的ND抗原制備的疫苗，以1/4倍效力檢驗用劑量(5 μL)免疫SPF雞，按現有ND滅活疫苗的質量標準進行效力檢驗，能夠達到標準要求，而且抗體在較高水平可以維持5周以上。因此，以ND病毒3倍濃縮的抗原制備的滅活疫苗，小劑量(0.1 mL)免疫1日齡肉雞，有望為飼養周期短的肉雞提供有效的保護。采用該生產工藝研制肉雞專用ND滅活疫苗，不僅能大大減少疫苗的使用劑量，同時疫苗的免疫效力也會相應提高，為肉雞ND的有效控制和食品安全提供保障。

[1]Alexander D J.Newcastle disease and other avian paramyxoviruses[J].Rev Sci Tech，2000，19(2):443-462.

[2]Herczeg J，Wehmann E，Bragg R R，et al.Two novel genetic groups(VIIb and VIII)responsible for recent newcastle disease outbreaks in Southern Africa，one(VIIb)of which reached southern Europe[J].Arch Virol，1999，144(11):2087-2099.

[3]Katienbelt J A，Stevens M P，Gould A R.Sequence variantion in the Newcastle disease virus genome[J].Virus Research，2006，l16(3):168-184.

[4]Liu X F，Wan H Q，Ni X X，et al.Pathotypical and genotypical characterization of strains of newcastle disease virus isolated from outbreaks in chicken and goose flocks in some regions of China during 1985-2001[J].Arch Viro，2003，148(7):1387-1403.

[5]陳立功，萬洪全，宋紅芹，等.不同基因型新城疫病毒株對鵝的致病性[J].中國獸醫學報，2005，25(2):131-134.

[6]農業部獸用生物制品規程委員會.中華人民共和國獸用生物制品規程2000年版[S].

[7]王繼華，邵 明，施程洪，等.抗原濃縮純化工藝降低口蹄疫O型和Asia 1型二價滅活疫苗免疫副反應研究[J].中國預防獸醫學報，2011，33(1):58-61.

[8]張 健，王英珍，巴 圖，等.禽用油乳劑滅活疫苗生產工藝改進——病毒濃縮試驗[J].動物科學與動物醫學，2002，19(8):29-30.

[9]姜北宇，劉月煥，景小冬，等.禽用疫苗病毒濃縮技術的研究[J].華北農學報，2007，22(5):165-171.