幾種抗菌藥物對嗜水氣單胞菌突變選擇窗（MSW）范圍的研究

俞觀泉，盧彤巖，楊雨輝

（1.海南大學農(nóng)學院，海南 海口570228；2.中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所 ，黑龍江 哈爾濱150070）

傳統(tǒng)藥效理論認為，當抗菌藥物濃度低于MIC時，容易被篩選出耐藥菌株，從而導致細菌耐藥。因此在以往的給藥方案設計中，給藥間隔的設計主要是根據(jù)MIC來確定［1］。但最近提出的突變選擇窗（Mutation Selection Windows，MSW）概念改變了傳統(tǒng)上的這一理論，突變選擇窗理論認為病原菌與藥物接觸過程中，有一個高于MIC的濃度范圍可以殺死或抑制敏感細菌，但是在感染細菌群體中少數(shù)自發(fā)突變耐藥的細菌則可能存活下來，并得以繁殖。一般將這個濃度范圍稱為 MSW［1－4］。突變選擇窗的下限是MIC和MIC99之間的范圍，突變選擇窗的上限被定義為當體內(nèi)試驗細菌為1010個時，無耐藥突變株生長的藥物濃度，即防突變濃度（MPC）。當藥物濃度低于MIC時，由于藥物濃度較低而未作用于耐藥突變菌群，因此不會產(chǎn)生耐藥，但也不能達到預期的治療目的；當藥物濃度高于MPC時，由于病菌必須同時產(chǎn)生兩種或兩種以上的耐藥突變才能生長，因此也不可能產(chǎn)生耐藥；只有當藥物濃度高于MIC并低于MPC時，即藥物濃度處于MSW范圍之內(nèi)的時候，才容易導致耐藥突變菌的選擇性擴增并產(chǎn)生耐藥性［2－4］。

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）屬于弧菌科（Vibrionaceae）氣單胞菌屬的細菌（Aeromonas），是一種革蘭陰性兼性厭氧的短桿菌［5］。廣泛存在于淡水、污水、淤泥、土壤中，是自然界中的一種常見菌。大部分菌株一般無致病性，但致病菌株可引起魚類、兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳類感染［6］。人也可以感染嗜水氣單胞菌而引起腹瀉，是一種典型的人－獸－魚共患病原菌。目前關(guān)于抗菌藥物對嗜水氣單胞菌MIC和 MBC的測定已有文獻報道［7］，但關(guān)于MSW的研究還未見報道，針對于此，本研究進行了幾種常用抗菌藥物對嗜水氣單胞菌MSW的研究，旨在為制定抗菌藥物的合理給藥方案提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 待測菌株 本研究使用的嗜水氣單胞菌均分離自東北三省患病的水生動物。

1.2 抗菌藥物 鹽酸恩諾沙星由浙江國邦藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；氟苯尼考由湖北中牧安達藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；卡那霉素（Biosharp／Amresco 0408）。

1.3 培養(yǎng)基 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.4 方法［8－10］

1.4.1 細菌數(shù)量的測定 挑取單個菌落接種于6 mL肉湯中30℃恒溫預培養(yǎng)12h，取0.1mL菌液接種于100mL的肉湯中30℃、100r／min震蕩培養(yǎng)12 h，平板計數(shù)法測細菌數(shù)量，30℃培養(yǎng)12h后計數(shù)。

1.4.2 MIC和MIC99的測定 試管雙倍稀釋法測MIC，把濃度為1.28mg／mL的藥液以1∶9的比例加入到肉湯中，用雙倍稀釋法稀釋至13個濃度梯度。最終不同含藥肉湯的體積均為0.5mL。把稀釋后的菌液加入到含藥肉湯中，使每個濃度的肉湯中含菌量為3×105CFU。30℃培養(yǎng)16～18h后觀察結(jié)果。以最低不長菌的濃度為MIC。相同過程重復5次。

在MIC的基礎(chǔ)上線性遞減20%抗菌藥濃度制成平板，把不同稀釋度的菌液接種于平板上，使每個藥物的濃度藥物平板上的含菌量為3×102、3×103、3×104、3×105CFU。30℃培養(yǎng)24h后，選合適的平板計數(shù)。限制99%的細菌生長的平板藥物濃度為MIC99。

1.4.3 MPC的測定 分別以2MIC、4MIC、8MIC、16MIC濃度的抗菌藥物制作藥物平板，濃縮菌液并調(diào)整濃度。每個藥物平板接種0.1mL菌液，每個藥物濃度4個平板，使每個濃度最終接種菌的量達到1.2×1010CFU。30℃下培養(yǎng)72h，觀察結(jié)果，最低不長菌的濃度為MPCpr。在MPCpr的基礎(chǔ)上線性遞減20%制作藥物平板，以相同的方法接種細菌。最低不長菌的濃度就是MPC。

2 結(jié)果

3種抗菌藥對5株臨床分離的嗜水氣單胞菌的MIC99和MPC結(jié)果見表1。

表1 3種抗菌藥對5個嗜水氣單胞菌的MIC99和MPC

由結(jié)果可見，卡那霉素和鹽酸恩諾沙星對5株嗜水氣單胞菌的MIC99相差不大，但MPC之間有較大的差異：卡那霉素對4號菌株的MPC明顯大于其他幾個菌株，恩諾沙星對2號菌株的MPC明顯小于其他菌株；氟苯尼考對2號菌株MIC99明顯大于其他4株嗜水氣單胞菌，而MPC值均大于128μg／mL。

3 討論

由結(jié)果可見，恩諾沙星對5株嗜水氣單胞菌MIC99相差不大，恩諾沙星對2號菌株的MPC明顯小于其他菌株，故恩諾沙星對2號菌株的MSW也明顯小于其他菌株。卡那霉素對5株嗜水氣單胞菌MIC值變化不明顯，但各菌株之間MPC有明顯差異。其中2號菌株的MPC最低，4號菌株的MPC最高。5株嗜水氣單胞菌中除2號菌株外，氟苯尼考對其他菌株的MIC相差不明顯，而2號菌株的MIC明顯高于其他菌株。由于氟苯尼考對5株嗜水氣單胞菌的MPC均高于128μg／mL而未測出，故表中標記菌株對氟苯尼考的MPC為未知。這種MIC相差不明顯，而MPC相差較大的原因，目前還不得而知，可能與菌株產(chǎn)生耐藥突變的基因不同有關(guān)，具體原因還需要進一步研究。

根據(jù)以前一些關(guān)于氟喹諾酮類藥物對病原菌MIC和MPC的測定結(jié)果來看，MPC／MIC的范圍在4～12之間［11－12］，在本研究中，測定的恩諾沙星對嗜水氣單胞菌的MPC／MIC在5～18之間，以前文獻報道的MPC／MIC的范圍更寬，這可能說明臨床分離的病原菌對藥物的敏感性差異非常大，同時說明了相同的給藥方案對不同病例的治療結(jié)果可能會有很大的差異。

傳統(tǒng)抗菌藥物的藥效學理論認為［1－2］，給藥方案的制定應該以MIC為依據(jù)，藥物濃度高于MIC是保證治療效果的最基本的要求。但MSW理論認為藥物濃度達到MIC值有一定的治療效果，但易產(chǎn)生耐藥菌。因而治療量應該用高于MPC的濃度。MSW理論的出現(xiàn)對抗菌藥物的使用和研究提出了更高的要求，該理論不僅關(guān)注治療效果，更將耐藥性的產(chǎn)生因素考慮在內(nèi)，因此在該理論指導下制定的給藥方案更能合理應用抗菌藥物，防止耐藥性的產(chǎn)生和擴散。由本研究的結(jié)果與恩諾沙星和氟苯尼考現(xiàn)有的在水生動物體內(nèi)的藥動學數(shù)據(jù)［13－15］共同分析認為，恩諾沙星在鯉魚體內(nèi)藥物濃度達到峰濃度后20h以上高于MIC，但是恩諾沙星在鯉魚體內(nèi)達到峰濃度后只13h和15h內(nèi)分別高于4號和2號菌株的MPC，對于其他菌株維持在MPC之上的時間則較短。氟苯尼考在羅非魚體內(nèi)的藥物濃度在達到峰濃度后15h時仍高于MIC，但是其峰濃度卻遠低于MPC。因此認為，目前恩諾沙星和氟苯尼考的給藥方案雖可發(fā)揮一定的治療效果，但容易導致細菌耐藥性的產(chǎn)生。卡那霉素由于缺乏相關(guān)的藥動數(shù)據(jù)，因此未對卡那霉素的藥效及耐藥進行分析。

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